关键词:
肌萎缩,脊髓性
模型,动物
小鼠,转基因
运动神经元生存蛋白1
运动神经元生存蛋白2
摘要:
目的通过杂合子基因工程鼠交配繁育及基因型鉴定筛选构建脊髓性肌萎缩(SMA)小鼠模型,并对构建的子代SMA小鼠的生物学特征进行初步探讨。方法通过***Δ7杂合小鼠(雌性8只,雄性4只)交配繁育获得SMA模型鼠;通过子代小鼠鼠尾基因组DNA模版进行聚合酶链式反应(PCR)得到运动神经元生存蛋白1(SMN1)基因的扩增产物,通过琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型以筛选出SMA模型鼠;根据基因型鉴定的结果,将实验小鼠分为野生型、杂合子和SMA 3组;通过翻正反射实验及肌纤维密度测定检测新生SMA小鼠的体格和肌肉发育情况(n=5);通过不同发育时间点小鼠的体质量测定、翻正反射实验和小鼠生存曲线分析评估子代小鼠的个体发育情况(n=6);通过免疫组织化学(IHC)、免疫荧光(IF)和蛋白质免疫印迹(WB)实验检测脊髓SMN蛋白表达情况(n=3)。结果基因检测显示,***Δ7杂合小鼠交配繁育的子代小鼠25%(8/32)为突变型SMN1基因纯合个体,即SMA小鼠;翻正反射时间显示,SMA小鼠翻正反射时间较杂合子、野生型小鼠均延长(t值分别为7.48、16.48,均P<0.05);小鼠后肢肌纤维密度测定结果显示,SMA小鼠比目鱼肌和胫骨前肌单位横截面积肌纤维数量均少于野生型、杂合子小鼠(均P<0.05);小鼠的体质量连续测量结果显示,第0、1、7、10、13天,SMA小鼠的体质量较野生型、杂合子小鼠均低(均P<0.05);并且在不同时间点,子代SMA小鼠的翻正反射时间较野生型、杂合子小鼠均延长(均P<0.05);生存曲线分析显示,SMA小鼠无法正常发育至性成熟,中位生存时间为(14.80±2.60)d,均低于野生型和杂合子小鼠(均P<0.05);IHC结果显示,SMA小鼠脊髓中SMN蛋白表达水平较野生型、杂合子小鼠均降低(t值分别为41.78、15.36,均P<0.05);IF和WB结果均显示,SMA小鼠脊髓中SMN蛋白表达水平较野生型、杂合子小鼠均降低(均P<0.05)。结论本研究成功构建了SMA小鼠模型;子代SMA小鼠表现出较差的体格和肌肉发育水平,个体发育迟缓且脊髓SMN蛋白表达水平降低,符合SMA的病理学表现。