关键词:
猪胰蛋白酶
原核表达
基因重组
单克隆抗体
生物学特征
摘要:
目的制备重组猪胰蛋白酶(recombinant porcine trypsin,RPT)单克隆抗体,并鉴定其生物学特性,以期为后续RPT检测产品的研发奠定基础。方法采用PCR法扩增PT基因,克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET-28a(+)-RPT,进行菌落PCR及测序鉴定。将原核表达质粒转化感受态*** BL21(DE3),经IPTG诱导表达及Ni-NTA亲和层析纯化获得RPT。通过杂交瘤技术将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与经RPT免疫的BALB/c小鼠脾细胞进行融合,筛选出稳定分泌特异性RPT单克隆抗体的杂交瘤细胞,注入小鼠腹腔,制备腹水,ELISA法筛选阳性单克隆抗体,并进行效价、亚型、抗原结合特性及抗体特异性鉴定。结果经菌落PCR及测序鉴定,原核表达质粒pET-28a(+)-RPT构建正确。RPT相对分子质量约为24000,主要以可溶形式存在于上清中,纯化后纯度达90%以上。筛选获得2株阳性单克隆抗体,分别为RPT-4A5C5和RPT-4D6D11,效价均>1∶1280000;均为IgG1亚型,抗体轻链均为Kappa链;均可与RPT及天然PT发生特异性反应,与重组羧肽酶B蛋白(recombinant carboxypeptidase B,RCPB)、重组肠激酶蛋白(recombinant enterokinase,REK)、精子蛋白10(sperm protein 10,SP10)及牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)无明显交叉反应。结论经原核系统表达了RPT,并通过杂交瘤技术制备了高效价、高特异性的RPT单克隆抗体。