丝氨酸蛋白酶在细粒棘球绦虫中的表达及活性鉴定

作     者：田梦潇 臧小燕 郭刚 齐文静 郭宝平 任远 李军 张文宝 TIAN Meng-xiao;ZANG Xiao-yan;GUO Gang;QI Wen-jing;GUO Bao-ping;REN Yuan;LI Jun;ZHANG Wen-bao

作者机构：新疆医科大学基础医学院乌鲁木齐830017 中亚高发病成因与防治国家重点实验室临床医学研究院新疆医科大学第一附属医院乌鲁木齐830054 

出 版 物：《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 (Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases)

年 卷 期：2021年第39卷第2期

页      面：233-239页

核心收录：

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金(81830066 U1803282) 

主　　题：细粒棘球绦虫 丝氨酸蛋白酶 原头节 生发层 

摘      要：目的比较细粒棘球绦虫丝氨酸蛋白酶(EgSP)在原头节、生发层(包囊)和成虫中的表达水平差异及活性鉴定。方法采用TRIzol试剂分别提取细粒棘球绦虫原头节(经胃蛋白酶消化和未经胃蛋白酶消化)、生发层(包囊)和成虫总RNA,并进行PCR分别扩增EgSP基因片段,PCR扩增产物测序后通过Clustal×2.0软件进行序列比对,采用邻接法构建系统进化树。选择具有SP活性基团的38 000亚基基因序列进行原核表达,将正确的目的片段克隆至表达载体pET-30a中,再转化至大肠埃希菌BL21中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,用His标签亲和层析纯化柱纯化重组蛋白EgSP(rEgSP)。将rEgSP(25μg)与等量的弗氏完全佐剂混合乳化,皮下多点注射免疫5只BALB/c小鼠,从第2次免疫开始,改为等量的弗氏不完全佐剂,第4次加强免疫采用腹腔注射,每次免疫间隔1周。免疫结束后,尾静脉采血,分离血清。ELISA检测血清中特异性抗体水平。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)测定不同阶段中EgSP mRNA的相对表达水平。蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测细粒棘球绦虫不同阶段中EgSP的表达情况,采用Image Lab 6.0软件分析蛋白质的表达丰度。免疫组化检测EgSP在细粒棘球绦虫原头节和生发层(包囊)中的表达情况。纯化的rEgSP和囊液蛋白用胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸酶底物(Z-Arg-AMC)、组织蛋白酶L底物(Z-Phe-Arg-AMC)测定其蛋白酶活性。采用Graphpad Prism 7统计学软件对多组数据进行单因素ANOVA方差分析。结果细粒棘球绦虫原头节、生发层(包囊)和成虫的cDNA中均扩增出目的片段,与预期大小(1 455 bp)相符。PCR产物测序结果显示,EgSP开放阅读框为1 455 bp,编码484个氨基酸,相对分子质量(Mr)为54 870,与多房棘球绦虫丝氨酸蛋白酶(Em SP)核苷酸序列一致性为97.73%,氨基酸序列一致性为96.69%。系统进化树分析结果显示,与其他绦虫属氨基酸序列一致性为33.10%~87.19%,其中与亚洲带绦虫(GenBank登录号:VDK43949.1),带状泡尾绦虫(GenBank登录号:VDM30859.1)的氨基酸序列一致性分别为87.19%、52.89%。qRT-PCR结果显示,胃蛋白酶消化的原头节、生发层(包囊)、成虫中EgSP mRNA的相对转录水平分别为2.1±1.2、9.1±2.1、5.8±2.3,均高于未经胃蛋白酶消化的原头节(1.0±0)(P0.01)。Western blotting分析结果显示,原头节、生发层(包囊)、成虫中EgSP蛋白相对表达水平分别为1.2±0.1, 3.6±0.2, 4.0±0.1,生发层(包囊)和成虫中的表达水平高于原头节(P0.01)。免疫组化分析结果显示,EgSP多克隆抗体能够特异性在生发层(包囊)中表达,而在原头节中不表达。在3种不同pH缓冲液中,rEgSP和囊液蛋白均具有蛋白酶活性,且在pH7.2的缓冲液中,rEgSP和囊液蛋白丝氨酸蛋白酶活性最强(P0.01)。结论EgSP在细粒棘球绦虫生发层(包囊)和成虫组织中高表达,原头节中表达较低。rEgSP和囊液蛋白均具有较强的丝氨酸蛋白酶活性。