猪瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR的建立与应用

作     者：姚俊 

作者机构：云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室昆明650224 

出 版 物：《中国动物传染病学报》 (Chinese Journal of Animal Infectious Diseases)

年 卷 期：2012年第20卷第6期

页      面：68-76页

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

基　　金：云南省自然科学基金项目(2010ZC225) 

主　　题：猪瘟病毒 TaqMan实时荧光定量PCR 建立 应用 

摘      要：为了建立一种既能检测野毒,又能检测疫苗毒的猪瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法,经过对GenBank中所有瘟病毒属成员高度保守的5 端非翻译区序列比对分析后,设计出1对TaqMan Real-time RT-PCR引物、1条TaqMan探针和3条RNA标准品制备引物。猪瘟病毒石门毒株经RNA标准品制备引物RT-PCR扩增后,再经T7 RNA聚合酶体外转录制备包含检测目的片断序列的猪瘟病毒RNA标准品。通过最佳引物、探针浓度的筛选及反应条件的优化,建立了猪瘟病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。该方法批内及批间重复试验变异系数均低于2%,特异性试验仅能检测出猪瘟强毒及疫苗毒株,最低浓度检测极限为1 X 102 copies/μL,上机检测时间少于60 min,建立的标准曲线斜率(Slope)为:-3.97,截距(Intercept)为:47.41,相关系数(R2)为:0.999779。运用该方法对3份猪瘟临床组织样品及6家企业生产的5种细胞苗及2种脾淋苗进行定量检测,结果提示:临床病料含有的病毒拷贝数差异不大,而疫苗产品每头份含有的病毒拷贝数差异较大。所建立的方法具有特异、快速、灵敏、可重复性和线性关系好的特点,不仅适合于猪瘟临床样品的早期检测,也适用于疫苗生产过程中的质控及疫苗制品的效价评估。