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日本血吸虫核糖核酸酶T2的表达及其功能分析

Expression and characterization of RNase-T2 of Schistosoma japonicum

作     者:柯雪丹 余传信 宋丽君 菊池三惠子 平山谦二 王玠 殷旭仁 金一 沈双 姚媛 高玒 高琪 

作者机构:苏州大学基础医学系寄生虫学教研室江苏苏州215021 江苏省血吸虫病防治研究所 卫生部寄生虫病预防与控制技术重点实验室 日本长崎大学热带医学研究所分子免疫遗传室 

出 版 物:《中国病原生物学杂志》 (Journal of Pathogen Biology)

年 卷 期:2013年第8卷第12期

页      面:1082-1088,1092页

学科分类:1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

基  金:国家自然科学基金项目(No.30671833 30972581) 江苏省自然科学基金项目(No.BK2008110) 国家传染病重大专项(No.2012ZX10004220) 江苏省博士后科研工作站无锡市人力资源和社会保障局资助项目 

主  题:血吸虫,日本 核糖核酸酶T2 表达 功能分析 免疫调节 

摘      要:目的制备重组日本血吸虫核糖核酸酶T2蛋白(rSj RNase T2),并分析其生物学功能。方法根据编码RNase T2开放阅读的基因序列设计、合成一对5′端带有酶切位点的引物。采用PCR方法从质粒CP1412/PEU-GST中扩增编码RNase T2蛋白成熟肽的基因片段,亚克隆到表达载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒Sj RNase T2-pET28a。将重组表达质粒转化到*** BL21中,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,用镍螯合亲和层析胶在变性条件下纯化rSj RNase T2蛋白。纯化蛋白通过尿素浓度梯度透析的方法进行复性,制备可溶性rSj RNase T2。以酵母RNA为底物进行消化,采用琼脂糖凝胶电泳的方法检测rSj RNase T2酶活性。用纯化的rSj RNase T2免疫小鼠,采用酶联免疫法(ELISA)检测小鼠血清特异抗体水平,观察其抗原性;采用检测Western blot抗rSj RNase T2抗体IgG与成虫可溶性虫抗原、成虫外分泌抗原、虫卵可溶性抗原和虫卵外分泌抗原的反应性,并观察Sj RNase T2在虫体中的分布。以rSj RNase T2刺激巨噬细胞RAW264.7,通过流式分析观察RAW264.7细胞表面标志物CD16/32、CD206表达水平的变化,采用RT-PCR检测RAW264.7细胞内诱导型一氧化氮合酶与精氨酸酶基因mRNA的表达水平,采用ELISA检测RAW264.7细胞培养上清液中IL-12及IL-10水平的变化,以观察Sj RNase T2的免疫调节功能。结果重组表达质粒Sj RNase T2-pET28a构建成功,经IPTG诱导,能表达重组Sj RNase T2蛋白。该蛋白以包涵体形式存在,经过复性能获得部分可溶性蛋白。rSj RNase T2具有酶活性,能够水解酵母RNA。ELISA检测rSj RNase T2免疫小鼠血清特异性抗体滴度为1︰200 000,该抗血清能识别来源于血吸虫虫卵及虫卵外分泌抗原中的天然RNase T2。rSj RNase T2可诱导巨噬细胞向M2型方向转化,表达高水平的IL-10、精氨酸酶及CD206表面分子。结论 rSj RNase T2表达成功。该蛋白具有天然的酶学特性和抗原性,能调节巨噬细胞向M2型方向分化。

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