多房棘球蚴Calpain A基因克隆、表达及其多克隆抗体制备

作     者：李慧敏 张少华 张月玥 王帅 生鸿鹏 李雅琪 王得先 蒋佳颖 LI Huiminl;ZHANG Shaohua;ZHANG Yueyue;WANG Shuai;SHENG Hongpeng;LI Yaqi;WANG Dexian;JIANG Jiaying

作者机构：青海大学医学部青海西宁810000 中国农业科学院兰州兽医研究所动物疫病防控全国重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室 

出 版 物：《中国病原生物学杂志》 (Journal of Pathogen Biology)

年 卷 期：2025年第20卷第1期

页      面：8-13页

核心收录：

学科分类：0906[农学-兽医学] 09[农学] 

基　　金：国家重点研发计划项目(No.2022YFD1302102-06) 国家自然科学基金项目(No.31772726) 青海大学医学部中青年科技项目(No.2023-kyy-2) 

主　　题：多房棘球蚴 Calpain A 序列分析 基因克隆 表达纯化 多克隆抗体 

摘      要：目的分析并克隆多房棘球蚴Calpain A(Em-Calpain A)基因开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)序列,进行体外诱导表达并制备兔多克隆抗体。方法从WormBase数据库下载多房棘球绦虫Em-Calpain A基因ORF序列。采用ProtParam、SMART等在线工具对其理化性质、蛋白结构域等进行分析和预测;利用MEGA 7.0软件的邻接法构建系统进化树。提取原头蚴总RNA并反转录为cDNA,PCR扩增Calpain A基因,构建pET28a-Em-Calpain A原核表达载体,经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白,纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用10%SDS-PAGE、Western blot和ELISA对重组蛋白纯度和抗体滴度及反应性进行鉴定。结果序列分析表明Em-Calpain A基因ORF长度为2469 bp,编码822个氨基酸,推测理论分子质量约92.13 ku,等电点为5.3。蛋白结构分析显示Em-Calpain A具有1个高度保守的钙蛋白酶样硫醇蛋白酶结构域(CysPc)、1个钙蛋白酶Ⅲ结构域(CalpainⅢ)和2个E、F的螺旋-环-螺旋结构(EF-hand),说明其属于钙蛋白酶家族。系统进化分析显示Em-Calpain A序列与带科绦虫聚于一类,与肝片吸虫、日本血吸虫、人、犬、牛及原虫亲缘关系较远。重组蛋白主要以包涵体形式表达,蛋白分子质量约为93 ku,与预测分子质量大小基本一致。ELISA检测结果显示制备的多克隆抗体效价达1∶262144;该抗体可特异性识别His-Em-Calpain A和原头蚴天然Calpain A蛋白。结论成功构建Em-Calpain A基因的原核表达系统并制备了其多克隆抗体,为研究该基因的功能奠定了基础。