去唾液酸糖蛋白受体的原核表达、纯化及活性分析

作     者：张峥嵘 陈邦航 乐壮 敖欣 张明珠 张振旺 苏延停 ZHANG Zheng-rong;ZHANG Zhen-wang;SU Yan-ting

作者机构：湖北科技学院医学部药学院湖北咸宁437100 湖北科技学院医学部基础医学院 湖北科技学院医学部医药研究院 

出 版 物：《湖北科技学院学报(医学版)》 (Journal of Hubei University of Science and Technology(Medical Sciences))

年 卷 期：2025年第39卷第1期

页      面：19-24页

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 

基　　金：国家自然科学基金青年基金项目(32000906) 湖北省自然科学基金面上项目(2024AFB1024) 

主　　题：去唾液酸糖蛋白受体 糖基化修饰 糖识别工具 Tn抗原 

摘      要：目的表达与纯化去唾液酸糖蛋白(ASGPR),为后续作为糖识别工具研究糖基化修饰的功能奠定基础。方法选择Nde I和Xho I作为限制性内切酶切割位点,使用SnapGene设计的上下游引物,以cDNA为模板,通过PCR扩增ASGPR基因。将扩增产物与经酶切的质粒pET-30a(+)使用一步克隆试剂盒进行重组。将重组产物转化到感受态大肠杆菌DH5α中,随后,将转化后的细菌溶液涂布在含有卡那霉素的LB平板(LBK板)上,以筛选出抗性菌落。之后,提取质粒并将重组质粒转化到表达菌BL21(DE3),筛选出抗性菌落,并进行测序验证。随后,进行ASGPR的小量诱导和蛋白的大量表达,接着进行蛋白包涵体复性过程。最后,收集不同的肿瘤细胞裂解液作为样品,利用纯化后的ASGPR蛋白作为糖识别工具,通过免疫印迹实验验证ASGPR的糖结合活性。结果重组质粒pET-30a(+)-ASGPR构建成功,通过免疫印迹实验证明ASGPR具有对GalNAc末端糖基化修饰的结合活性。结论基于O-GalNAc修饰(Tn抗原)的变化与多种疾病密切相关,所以高纯度且具有结合Tn抗原的ASGPR在未来对研究这种修饰功能具有巨大的推动作用。