结核分枝杆菌Rv2529基因的原核表达及功能初步分析

作     者：吴虞 秦守涛 丛薇 张蕊 李东 徐金彪 时坤 李健明 曾范利 WU Yu;QIN Shoutao;CONG Wei;ZHANG Rui;LI Dong;XU Jinbiao;SHI Kun;LI Jianming;ZENG Fanli

作者机构：吉林农业大学中药材学院 吉林市动物疫病预防控制中心 永吉县动物疫病预防控制中心 吉林农业大学动物科学技术学院 梅花鹿药用资源利用关键技术研究室 吉林省梅花鹿高效养殖和产品开发技术工程研究中心 教育部动物生产及产品质量安全重点实验室 

出 版 物：《吉林农业大学学报》 (Journal of Jilin Agricultural University)

年 卷 期：2025年第47卷第1期

页      面：161-168页

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

基　　金：吉林省科技发展计划重点研发项目(20210204038YY) 

主　　题：结核分枝杆菌 Rv2529基因 原核表达 RAW264. 7细胞 

摘      要：使用特异性引物扩增Myc标签序列，通过无缝克隆插入pMV261质粒，构建pMV261-Myc重组质粒。再以结核分枝杆菌H37Rv标准株基因组为模板，PCR扩增Rv2529基因片段，连接pMV261-Myc质粒并电转化E. coli DH5α感受态细胞。提取鉴定正确的阳性质粒，转化进耻垢分枝杆菌并诱导目的蛋白表达，通过SDSPAGE凝胶电泳和Western Blot对目的蛋白进行检测分析。接种Ms＿Rv2529和Ms＿pMV261重组菌株于7H9培养基后在恒温摇床培养，每3 h测1次OD600值并绘制成生长曲线。将重组菌株侵染RAW264.7，计算重组菌株的入侵率和细胞内生存率。结果表明：阳性质粒经HindⅢ和Eco RⅠ双酶切后电泳，得到4 488,1 428 bp 2条带，与预期大小一致。PCR扩增Rv2529基因片段，经测序后与NCBI数据库进行比对，结果一致。SDS-PAGE检测表达蛋白分子质量为50.2 kDa;Westrn blot检测出特异性阳性信号，且条带大小与SDS-PAGE相符。Ms＿Rv2529与Ms＿pMV261重组菌株的生长速率差异不显著，Ms＿Rv2529重组菌株的入侵率明显强于Ms＿pMV261重组菌株，在胞内生存率弱于Ms＿pMV261菌株。试验成功构建了包含结核分枝杆菌未知基因Rv2529的重组质粒，并在耻垢分枝杆菌中表达Rv2529蛋白。由于Rv2529蛋白在耻垢分枝杆菌内的表达，增强了重组耻垢分枝杆菌对小鼠巨噬细胞的入侵能力和防杀伤能力，这说明Rv2529基因与结核分枝杆菌的毒力相关，这为进一步探究Rv2529基因在结核分枝杆菌中的功能与作用奠定了基础。