实验动物肺炎克雷伯杆菌实时荧光qPCR检测方法的建立和优化

作     者：李钰钰 姚继英 田永路 孙甜甜 韦玉生 李夏莹 LI Yuyu;YAO Jiying;TIAN Yongu;SUN Tiantian;WEI Yusheng;LI Xiaying

作者机构：北京大学生命科学学院实验动物中心北京100871 北京大学心理与认知科学学院北京100871 

出 版 物：《实验技术与管理》 (Experimental Technology and Management)

年 卷 期：2025年第42卷第1期

页      面：90-97页

学科分类：0710[理学-生物学] 1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 100705[医学-微生物与生化药学] 07[理学] 071005[理学-微生物学] 10[医学] 

主　　题：肺炎克雷伯杆菌 荧光定量PCR 实验动物 

摘      要：该研究旨在建立和优化一种针对实验动物肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae,KP)的TaqMan实时荧光定量PCR(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测方法,以提高检测的灵敏度、特异性和准确性。通过文献调研和序列比对,选取了KP的phoE基因作为目标序列,设计并合成一对特异性引物和探针,对qPCR反应体系和退火温度进行了系统优化,采用梯度稀释法测定了该方法的线性范围、灵敏度和检测限。通过分析不同浓度标准品的qPCR曲线,评估了该方法的特异性和方法再现性。最后将该方法用于各种临床样品检测。优化后的qPCR方法显示出良好的线性关系,线性范围为2.7×10^(4)~8.64 copies/μL,线性回归方程为y=–3.83x+42.865,相关系数(R^(2))为0.992。检测限达到8.64 copies/μL,表明该方法具有较高的灵敏度。特异性实验结果表明,该方法仅对KP产生特异性扩增,与其他常见病原体无交叉反应。统计不同操作人员对检测极限样品的10个平行Ct值,结果显示,Ct值的相对标准偏差均低于2%,说明方法具有良好的再现性。共检测26份临床样本,有3份临床样本为阳性,其他均为阴性。本研究成功建立了一种高灵敏度、高特异性的KP qPCR检测方法,为实验动物中的KP感染提供了一种快速、准确的分子诊断工具。