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内蒙古自治区呼和浩特市赛罕区大学西街235号 邮编: 010021
作者机构:上海交通大学基础医学院病理生理学系上海200025
出 版 物:《上海交通大学学报(医学版)》 (Journal of Shanghai Jiao tong University:Medical Science)
年 卷 期:2024年第44卷第12期
页 面:1504-1513页
核心收录:
学科分类:0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 07[理学]
摘 要:目的·探讨睾丸素(testisin)酶原在体外的活化方式及活性调控机制,为进一步研究testisin在生物体内的生理功能奠定基础。方法·通过全基因合成,构建鼠源testisin(mTN)蛋白酶原的真核表达质粒,并将其转染至真核HEK293S细胞中;通过镍离子亲和层析等方法获得纯化重组testisin蛋白;将酶原激活位点和活性中心位点进行定点突变,利用酶活性检测等手段分析testisin的活化机制,通过改变酶原的孵育条件确定蛋白的活化速率;利用Edman降解法及定点突变确定蛋白酶的自剪切位点;通过检测蛋白对底物的分解速率分析蛋白酶的活性调控机制。结果·重组mTN酶原在真核HEK293S细胞中高效表达,通过一步纯化可以获得纯度较高且性质均一的重组蛋白。该蛋白在酸性条件下稳定,在中性或碱性环境下会发生自激活,其激活速率受到酸碱度和温度等因素的影响,且这种自激活依赖于该酶激活位点Arg46和酶活性中心Ser240的完整性。重组mTN酶原的活化常伴随分子表面170/175肽环的自剪切,但该自剪切并不影响其蛋白酶的活性。活化的mTN最适反应pH值为8.0,且在其最适pH值附近较为稳定;最适反应温度为50℃,且蛋白适宜保存在低于30℃的环境中;Zn^(2+)和Ca^(2+)对mTN的活性有明显的抑制作用。结论·成功建立了一种有效制备重组mTN酶原的方法,发现重组mTN在体外可以发生自激活和自剪切。