应用酵母双杂交系统筛选与蛋白激酶Pkmyt1相互作用的候选分子

作     者：刘超 孟智超 栾治东 任丽莉 刘乙蒙 肖建英 LIU Chao;MENG Zhi-chao;LUAN Zhi-dong;REN Li-li;LIU Yi-meng;XIAO Jian-ying

作者机构：锦州医科大学锦州医科大学基础医学院发育生物学教研室辽宁锦州121101 锦州医科大学基础医学实验教学中心辽宁锦州121101 锦州医科大学神经生物学教研室辽宁锦州121101 锦州医科大学教务处辽宁锦州121101 

出 版 物：《解剖学报》 (Acta Anatomica Sinica)

年 卷 期：2017年第48卷第1期

页      面：48-53页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 

基　　金：国家自然科学基金(81270698 31371173 81401199) 辽宁省科学技术计划项目(2015020697) 

主　　题：Pkmyt1 酵母双杂交 蛋白-蛋白相互作用 免疫印迹法 小鼠 

摘      要：目的蛋白激酶Pkmyt1负调控小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂的进程,但具体调控机制还不清楚。因此,利用酵母双杂交系统从人卵巢c DNA文库中筛选与Pkmyt1相互作用的候选蛋白,为研究Pkmyt1调控小鼠受精卵早期发育提供新线索。方法以小鼠卵巢组织c DNA为模板,构建p GBKT7-Pkmyt1诱饵质粒,转化酵母感受态细胞后,分别接种于SD/-Trp(SDO)、SD/-Trp/X-α-Gal(SDO/X)和SD/-Trp/X-α-Gal/Ab A plates(SDO/X/A)培养板,检测其对酵母的毒性和自身激活能力,Western blotting法检测p GBKT7-Pkmyt1在酵母细胞中的表达。将人卵巢c DNA文库与含有p GBKT7-Pkmyt1的酵母感受态细胞融合,PCR筛选出阳性克隆,提取质粒,测序鉴定,再次检测其对酵母自激活能力,利用生物信息学分析筛选蛋白与胚胎发育的关系。结果酶切鉴定和Blast分析表明p GBKT7-Pkmyt1质粒构建成功。将该质粒转入Y2H golden中,在SDO板上克隆均匀生长,在SDO/X/A平皿上无克隆生长,Western blotting检测Pkmyt1在酵母细胞中有表达。PCR验证融合后的阳性克隆质粒有插入片段。通过初步筛选得到182种能够与Pkmyt1相互作用的蛋白质,经回复性实验进一步验证有46个与Pkmyt1之间存在相互作用的蛋白。结论通过筛选发现46个蛋白可能通过与Pkmyt1相互作用调控小鼠卵母细胞成熟和受精卵早期发育。