华支睾吸虫胞浆苹果酸脱氢酶活性位点氨基酸点突变对酶活性和热稳定性影响

作     者：郑南才 黄宝明 徐劲 黄善盛 胡旭初 陈金中 余新炳 ZHENG Nan-cai;HUANG Bao-ming;XU Jin;HUANG Shan-sheng;HU Xu-chu;CHEN Jin-zhong;YU Xin-bing

作者机构：江门市疾病预防控制中心江门市529020 中山大学基础医学院病原生物学教研室 复旦大学生命科学院遗传研究所基因工程国家重点实验室 

出 版 物：《中国人兽共患病学报》 (Chinese Journal of Zoonoses)

年 卷 期：2006年第22卷第6期

页      面：575-579页

核心收录：

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

基　　金：广东省自然科学基金重点项目(NO.036627) 广东省科技计划项目重大专项(NO.2004A300801004) 

主　　题：华支睾吸虫 胞浆苹果酸脱氢酶 点突变 圆二色性 

摘      要：目的为了研究华支睾吸虫胞浆苹果酸脱氢酶H195及其周围氨基酸的点突变对酶活性和热稳定性的影响,进一步了解蛋白分子结构与功能的关系。方法利用PCR技术,对胞浆苹果酸脱氢酶H195及其周围氨基酸基因进行点突变,与pQE30质粒连接构建重组质粒,转染大肠杆菌后表达蛋白,测定酶活性和圆二色性,测定不同温度时222nm圆二色性改变,确定不同点突变蛋白的热稳定性。结果H195被异亮氨酸、半胱氨酸和酪氨酸置换后,酶活性下降了100倍以上,但随着H195被不同氨基酸置换和H195周围氨基酸被置换情况的不同,不同突变株表达的蛋白酶活性差别很大,H195/I195和H195/Y195突变株表达的蛋白酶活性明显高于H195N197/I195Y197和H195T198/C195M198突变株表达的蛋白酶活性;H195/Y195突变株表达的蛋白与未突变蛋白的二级结构差异明显;H195/Y195和H195T198/C195M198突变株表达的蛋白热稳定性明显降低,tm值分别为63.5℃和64℃,比Cs cMDH的tm值分别下降了4℃和3.5℃。结论活性中心H195的点突变可导致华支睾吸虫胞浆苹果酸脱氢酶活性的明显下降,而且H195被不同的氨基酸置换后可导致酶活性下降程度的不同,H195周围氨基酸被替换成具有形成氢键或二硫键的氨基酸后,导致酶活性下降更为明显;H195及其周围氨基酸的突变可导致蛋白质二级结构的改变和热稳定性的不同程度下降。