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一种适于PCR和LAMP检测的松木中松材线虫DNA快速提取方法

A Method for Rapidly Extracting DNA of Bursaphelenchus xylophilus from the Infested Pine Wood for PCR and LAMP Detection

作     者:苟大平 王曦茁 汪来发 田国忠 朱天辉 郭民伟 Gou Daping;Wang Xizhuo;Wang Laifa;Tian Guozhong;Zhu Tianhui;Guo Minwei

作者机构:四川农业大学林学院雅安625014 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所国家林业局森林保护学重点实验室北京100091 

出 版 物:《林业科学》 (Scientia Silvae Sinicae)

年 卷 期:2015年第51卷第6期

页      面:100-110页

核心收录:

学科分类:09[农学] 0904[农学-植物保护] 

基  金:国家高技术研究发展计划课题(2012AA101503) 

主  题:松材线虫 DNA提取 Chelex-100 

摘      要:【目的】本研究旨在探索快速、简便地直接从病木中提取松材线虫DNA的方法。【方法】运用Chelex-100结合异硫氰酸胍蛋白变性缓冲液建立新的高效快速提取微量木块中线虫DNA的方法,并通过普通PCR与环介导等温扩增(LAMP)对提取的DNA进行检测验证。【结果】建立了提取线虫DNA的新方法 Chelex-100法,并对影响提取效率的Chelex-100浓度、冻融时间和煮沸时间进行了优化。Chelex-100法最适Chelex-100终浓度为1.5%(W/V),最适冻融时间为5 min,最适煮沸时间为8 min。与传统的CTAB法和蛋白酶K法比较,Chelex-100法提取的DNA得率高,相同条件下,该方法提取的DNA浓度远远大于常规方法。3种方法的OD260/280比值从大到小依次为CTAB法蛋白酶K法≥Chelex-100法,Chelex-100法的OD260/280值显著低于CTAB法,而略低于或等同于蛋白酶K法,但这并不影响对提取的DNA进行PCR扩增。采用Chelex-100法提取松木中松材线虫的DNA,结合常规的PCR和LAMP检测,检测灵敏度高,特异性强,稳定性好;提取的松材线虫DNA的75倍稀释液再稀释32倍后进行PCR扩增,扩增产物电泳依然有清晰的条带。用新方法提取病木中线虫的DNA后进行检测,所有带病松木样品的检测结果均呈阳性,而健康黑松、马尾松、油松木屑及盘多毛孢样品的检测结果均呈阴性。此外,该提取方法简便快速,20 min内即可完成整个DNA的提取;经济方便,试剂保藏无特殊要求,单个样品提取耗费低于3.5元。【结论】Chelex-100法是一种快速有效的提取松木中松材线虫DNA的方法,此方法结合PCR和LAMP检测技术将进一步提高松材线虫的检测效率、灵敏度和准确性,可为松材线虫的野外检测提供可靠的技术依据。

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