靶向髓样细胞表达的激发受体1基因短发夹RNA真核质粒表达载体的构建及筛选

作     者：莫红缨 黎毅敏 肖正伦 黄红川 杨淳 何为群 刘晓清 MO Hong-ying;LI Yi-min;XIAO Zheng-lun;HUANG Hong-chuan;YANG Chun;HE Wei-qun;LIU Xiao-qing

作者机构：广州医学院第一附属医院广州呼吸疾病研究所呼吸疾病国家重点实验室510120 

出 版 物：《中华生物医学工程杂志》 (Chinese Journal of Biomedical Engineering)

年 卷 期：2011年第17卷第2期

页      面：128-133页

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金(30871135) 广东省自然科学基金博士启动项目(9451018201003655) 

主　　题：髓样细胞表达的激发受体1 短发夹RNA 质粒 RNA干扰 基因表达 

摘      要：目的 构建编码髓样细胞表达的激发受体1（TREM-1）基因短发夹RNA（shRNA）真核质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法 针对TREM-1的靶位点设计含shRNA的靶序列,分别构建pGCsi-TREM-1 shRNA1和pGCsi-TREM-1 shRNA2的质粒表达载体和pGCsi-NegshRNA阴性质粒表达载体,通过酶切及测序进行鉴定.鉴定后以脂质体包裹转染肺泡上皮A549细胞,分为未转染对照组（A组）、转染空质粒载体pGCsi对照组（B组）、转染阴性shRNA质粒表达载体pGCsi-NegshRNA对照组（C组）、转染TREM-1 shRNA1质粒表达载体组（D组）和转染TREM-1shRNA2质粒表达载体组（E组）,48 h后观察转染细胞绿色荧光蛋白表达效果.转染24、48、72 h后,以A组为对照采用MTT法测定B、C、D、E组细胞的存活率.转染48 h后,通过荧光定量PCR检测各组TREM-1 mRNA的表达水平并与转染前相比较.结果 经酶切和测序鉴定证实,目的 TREM-1基因shRNA1和shRNA2片段已被克隆到pGCsi载体中.荧光显微镜下,B、C、D、E组A549细胞有明显的绿色荧光蛋白表达.各时间点B、C、D、E组细胞存活率均达90%以上.A、B、C 3组转染前后TREM-1mRNA的表达水平差异无统计学意义,D、E组转染的重组质粒均能有效抑制A549细胞的TREM-1mRNA的表达（[（1.945±0.252）×105比（1.010±0.194）×105,（1.933±0.216）×105比（1.202±0.171）×105,均P0.05],抑制率分别为48.07%和37.82%.结论 成功构建了靶向TREM-1基因的shRNA质粒表达载体,可有效抑制细胞中TREM-1目的 基因的表达,为后续脓毒症的基因治疗提供了依据.