黄芩苷体外诱导人脐血间充质干细胞向神经元样细胞的分化

作     者：颜小华 黄瑞滨 陈启文 Yan Xiao-hua;Huang Rui-bin;Chen Qi-wen

作者机构：南昌大学第一附属医院儿科江西省南昌市330006 南昌大学第一附属医院血液病学科江西省南昌市330006 

出 版 物：《中国组织工程研究与临床康复》 (Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research)

年 卷 期：2008年第12卷第16期

页      面：3074-3078页

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

主　　题：脐血间充质干细胞 黄芩苷 神经元 β-巯基乙醇 预诱导 

摘      要：目的：体外诱导脐血间充质干细胞定向分化为神经元包括抗氧化剂法及细胞因子法,如何选择一种既能够如细胞因子般可广泛保护神经,又具有较强抗氧化作用的诱导剂？通过广泛筛选,观察中药单体黄芩苷对人脐血间充质干细胞体外纯化、扩增及向神经元样细胞诱导分化的作用。方法：实验于2005-02/06在南昌大学第一附属医院神经内科实验室完成。①对象及药物：无内外科并发症和传染性疾病、无血液系统疾病、乙肝表面抗原阴性、非高危妊娠、年龄23-35岁的健康孕妇足月顺产儿的脐带血10份,由南昌大学第一附属医院产科提供,孕妇及其家属对治疗及实验均签署知情同意书，实验经医院医学伦理委员会批准。黄芩苷，分子量446，纯度〉95％，由中南大学湘雅医学院药剂科提供。抗氧化添加剂β-巯基乙醇为SABC公司产品。②实验方法：无菌条件下采集胎儿脐带血，肝素抗凝，用明胶沉降＋密度梯度离心两步法分离出脐血单个核细胞，经冷冻保存和复苏后，调整细胞浓度为1×10^9L^-1，以含20％胎牛血清、谷氨酰胺、B27、粒巨噬细胞集落刺激因子300μg/L、干细胞因子300μg/L的DMEM液体培养基进行纯化和扩增。按照抗氧化添加剂的不同分为4组：黄芩苷组加入黄芩苷100μmol／L：空白对照组不添加抗氧化剂；β-巯基乙醇组添加β-巯基乙醇2mmol／L；共培养组添加黄芩苷100μmol／L、β-巯基乙醇2mmol／L。连续培养4周。③实验评估：观察细胞形态学变化；采用流式细胞仪检测间充质干细胞表面标志；制作细胞爬片，采用免疫细胞化学染色评价神经细胞特异性烯醇化酶、神经微管相关蛋白2、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达率。结果：①细胞形态学观察：脐血单个核细胞培养第2—3天开始贴壁生长，2周左右达高峰，3周后细胞生长达80％-90％融合，此时脐血原始间充质干细胞呈较均一的长梭形。4周后，黄芩苷组原来呈梭形的胞体一部分发生收缩，细胞边缘出现细的突起；一部分胞体逐渐近似圆形、锥形、三角形，伪足有多个细长突起，且发出分支，形成圆锥状终末端。β-巯基乙醇组、共培养组细胞虽然也有上述类似形态学的改变，但少量细胞存在脱落、死亡现象，且随着培养时间延长呈逐渐增加的趋势。②细胞表型检测：扩增培养4周后，空白对照组以CD45阳性细胞为主；其余3组均以CD29和CD83阳性细胞为主，其中共培养组最多，黄芩苷组次之，β-巯基乙醇组最少，组间两两比较差异有显著性意义（P〈0．01）：各组贴壁生长细胞中均未见CD34^＋阳性细胞。③细胞扩增培养过程中黄芩苷的预诱导效果：扩增培养4周后与黄芩苷组比较，空白对照组、β-巯基乙醇组神经细胞特异性烯醇化酶及神经微管相关蛋白2阳性细胞表达率均显著降低（P〈0．01），共培养组无明显差异（P〉0．05）。各组胶质纤维酸性蛋白阳性细胞表达率均低于1％。结论：100μmol／L黄芩苷可促进脐血间充质干细胞体外扩增，且随抗氧化作用时间的延长效果显著增强，同时在一定程度上还能够诱导其向神经元样细胞方向分化。