构建psiCHECK-2-解耦联蛋白2双荧光素酶报告基因及其荧光素酶活性的分析

作     者：琚丽萍 邱妙颜 陈瑛 田景琰 

作者机构：上海交通大学医学院附属瑞金医院内分泌代谢病科上海市内分泌代谢病临床医学中心上海市内分泌代谢病研究所上海200025 

出 版 物：《内科理论与实践》 (Journal of Internal Medicine Concepts & Practice)

年 卷 期：2013年第8卷第6期

页      面：414-418页

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：国家自然科学基金(项目编号:81270935) 上海市科委自然科学基金(项目编号:11ZR1431900) 上海市卫生局课题(项目编号:2012-301) 

主　　题：解耦联蛋白2 微小RNA-15b 双荧光素酶报告基因 

摘      要：目的:构建含解耦联蛋白2(UCP2)-3’非翻译区(UTR)序列的野生型和突变型质粒的双荧光素酶报告基因载体,探讨微小RNA(miR)-15b对UCP2基因表达的调控作用。方法:应用生物信息软件预测miR-15b的靶基因,分别将预测靶基因UCP2的3’UTR及其突变体克隆到荧光素酶载体psiCHECK-2骨架中,构建UCP2野生型和突变型质粒。并采用测序方法鉴定psiCHECK-2-UCP2载体是否构建成功。将UCP2野生型和突变型质粒分别与miR-15b模拟物、miR-15b模拟物正常对照、miR-15b抑制剂、miR-15b抑制剂正常对照在293T细胞中共转染。通过双荧光素酶报告基因检测分析miR-15b对UCP2基因表达的调控作用。结果:测序鉴定证实psiCHECK-2-UCP2双荧光素酶报告基因载体构建成功。双荧光素酶报告基因检测显示转染UCP2野生型和UCP2突变型报告基因的293T细胞过表达miR-15b后,UCP2野生型报告基因的荧光素酶活性明显下降,下调31%(P=0.003),过表达miR-15b抑制剂后,UCP2野生型报告基因的荧光素酶活性明显增加,上调46%(P=0.01)。而miR-15b模拟物、miR-15b模拟物正常对照、miR-15b抑制剂、miR-15b抑制剂正常对照对UCP2突变型的表达均无明显影响(P0.05)。结论:UCP2是miR-15b直接作用的靶基因,且miR-15b结合于UCP2基因3’UTR区域,转录后水平对UCP2有直接的抑制作用。