SDF-1/RUNX1融合蛋白腺病毒载体的构建及滴度测定

作     者：罗红春 张红宾 秦波 汪嘉莉 刘倩 Luo Hongchun;Zhang Hongbin;Qin Bo;Wang Jiali;Liu Qian

作者机构：重庆医科大学附属第一医院感染科400016 重庆医科大学附属第一医院血液科400016 重庆医科大学附属第一医院/重庆市传染病寄生虫病学重点实验室400016 重庆市渝北区人民医院消化内科401120 

出 版 物：《重庆医学》 (Chongqing medicine)

年 卷 期：2012年第41卷第12期

页      面：1200-1202,I0001,F0002页

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：重庆市卫生局医学科研计划资助项目(2010-2-095) 

主　　题：基质细胞衍生因子-1 RUNX1基因 间充质干细胞 造血干细胞 

摘      要：目的构建SDF-1/RUNX1融合蛋白腺病毒表达载体,并测定其滴度,为研究SDF-1/RUNX1融合蛋白介导的间充质干细胞对造血干细胞定向募集的作用打下基础。方法全基因合成SDF-1-(GlySer)3-RUNX1片段,并在其两端添加限制性酶切位点XhoI及EcoRI,经测序验证基因序列是否正确。采用分子克隆技术构建pAD-SDF-1-(GlySer)3-RUNX1-IRES-GFP腺病毒载体,转染入293A细胞中进行包装,采用免疫法测定腺病毒滴度。结果全基因合成SDF-1-(GlySer)3-RUNX1片段经测序验证基因序列正确,长约3 000bp。将其连接至目的载体pIRES2-EGFP,构建出含有SDF-1-(GlySer)3-RUNX1基因序列的GFP共表达质粒编号为B。以B质粒为模板,扩增出带attB1和attB2位点的SDF-1-(GlySer)3-RUNX1-IRES-EGFP片段,长约4 300bp。采用BP重组系统将上述目的片段重组到载体pDONR221,构建出BP重组质粒C。再采用LR重组系统将目的序列重组到腺病毒载体pAD/CMV/v5-DEST上,构建出pAD-SDF-1-(GlySer)3-RUNX1-IRES-GFP腺病毒载体。经293细胞包装后,采用免疫法测定腺病毒滴度为1.03×1011 ifu/mL。结论成功构建出SDF-11/RUNX1融合蛋白腺病毒表达载体,且腺病毒滴度较高,有利于后续试验。