鼠B7-H4基因重组腺病毒的构建及其在B16F10细胞中的表达、鉴定

作     者：段文元 白云 罗娜 许雪青 

作者机构：第三军医大学医学遗传学教研室重庆400038 

出 版 物：《重庆医学》 (Chongqing medicine)

年 卷 期：2006年第35卷第7期

页      面：617-619页

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 08[工学] 09[农学] 100102[医学-免疫学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金资助项目(30271246) 

主　　题：B7-H4 基因工程 同源重组 

摘      要：目的构建表达鼠B7-H4的重组腺病毒并检测其在B16F10细胞中的表达。方法采用RT-PCR技术,取小鼠肺脏,TriPure提取肺脏总RNA,反转录得到cDNA序列,PCR扩增B7-H4全长,克隆到plenti6/V5克隆载体中并经过测序证实与标准序列一致。加入适当的酶切位点,双酶切PCR扩增产物连接入pAd track CMV中构建成腺病毒穿梭质粒pAd track CMVmB7-H4,经酶切线性化后,用CaCl2的方法转化到含有腺病毒骨架质粒pAd Easy的BJ 5183大肠杆菌中,挑选同源重组菌落提取质粒,酶切线性化重组质粒并转染293细胞,包装成重组病毒颗粒。重组病毒上清感染B16F10细胞,并用PE标记的B7-H4单克隆抗体检测B16F10细胞mB7-H4蛋白的表达。结果RT-PCR扩增得到含编码mB7-H4的860 bp基因片段,与预期大小一致,并经过测序证实与标准序列一致。成功构建了mB7-H4重组腺病毒,病毒滴度达到3×1013pfu/ml,pAd mB7-H4重组腺病毒表达载体感染B16F10细胞后,荧光显微镜观察显示PE标记的mB7-H4单克隆抗体染色B16F10细胞阳性。结论成功构建了mB7-H4重组腺病毒,转染B16F10细胞后表达出有活性的B7-H4蛋白,为进一步研究B7-H4分子在器官移植、自身免疫性疾病以及肿瘤逃逸机制中的作用奠定了基础。