利用CRISPR/Cas9技术缺失MDV分离株meq基因的研究

作     者：张峰 于正浩 兰兴鸽 张艳萍 王永强 高立 高玉龙 李凯 祁小乐 崔红玉 潘青 王笑梅 刘长军 ZHANG Feng;YU Zhenghao;LAN Xingge;ZHANG Yanping;WANG Yongqiang;GAO Li;GAO Yulong;LI Kai;QI Xiaole;CUI Hongyu;PAN Qing;WANG Xiaomei;LIU Changjun

作者机构：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室禽传染病研究室黑龙江哈尔滨150001 江苏省动物重要疫病与人畜共患病协同创新中心江苏扬州225009 

出 版 物：《中国家禽》 (China Poultry)

年 卷 期：2019年第41卷第9期

页      面：26-32页

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

基　　金：黑龙江省自然科学基金项目(C2018068) 国家自然科学基金项目(31670155) 国家重点研发计划(2017YFD0500101、2017YFD0500704) 

主　　题：MDV CRISPR/Cas9 基因编辑 meq基因 

摘      要：鸡马立克氏病病毒(MDV)是一种能够引起鸡肿瘤的疱疹病毒,具有严格的细胞结合特性,对其基因组编辑较为困难。研究利用CRISPR/Cas9技术对中国MDV分离株基因组中的meq基因进行缺失。依据中国MDV分离株BS/15株的meq基因序列,设计了8条靶向meq基因的小向导RNA(sgRNA),分别克隆到pX330质粒中,构建表达靶向meq基因sgRNA的质粒pMeqsgRNA。通过pMeq-sgRNA转染、测序分析方法初步评价sgRNA切割效果,选择了两条适合的sgRNA。在鸡胚成纤维细胞(CEF)上同时转染上述筛选的2个pMeq-sgRNA质粒,接种MDV分离株BS/15株,通过PCR检测筛选meq基因缺失克隆株,成功克隆到一株meq基因缺失株。序列分析证明获得的MDV重组毒株确定meq基因序列已被敲除。体外试验证明该MDV重组毒株与亲本毒株在CEF上具有相似的复制能力。研究提供了一种简单、快捷的编辑MDV基因的方法,为MDV功能基因、分子进化和新型基因工程疫苗的研究提供了技术支持。