汉坦病毒S片段荧光定量PCR参考标准品的构建

作     者：周欣 李燕婷 沈荣明 沈微娟 瞿涤 ZHOU Xin;LI Yan-ting;SHEN Rong-ming;SHEN Wei-juan;QU Di

作者机构：复旦大学上海医学院医学分子病毒学教育部重点实验室上海200032 上海市疾病预防控制中心上海200336 

出 版 物：《上海预防医学》 (Shanghai Journal of Preventive Medicine)

年 卷 期：2006年第18卷第9期

页      面：432-434页

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主　　题：S片段 实时荧光定量PCR 标准品 

摘      要：[目的]构建汉坦病毒S片段标准品,用于实时荧光定量PCR检测汉坦病毒。[方法]对S片段基因进行序列分析,利用引物设计软件设计出一对引物和一条荧光探针,提取病人总RNA,逆转录为cDNA,经PCR扩增,产物纯化后与PMD 18-T Vector连接,转化到大肠杆菌DH5α,筛选得到标准品的质粒,提取质粒并进行定量。[结果]重组S片段基因质粒进行荧光定量PCR扩增出现强烈的荧光值增长,表明基因已成功克隆。以不同稀释水平的标准品进行扩增,统计学分析显示C t值与标准品浓度的对数存在良好线性关系,回归系数在0.99以上。成功制备并获得稳定的S片段重组质粒。[结论]该方法能大量制备质粒标准品,如何进行荧光RT-PCR条件的优化是关键所在。