绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)丙酮酸脱氢酶E1-α亚单位基因(pdha)的克隆、表达及其免疫学活性测定

作     者：许健 储岳峰 高鹏程 赵萍 贺英 剡根强 逯忠新 XU Jian;CHU Yue-Feng;GAO Peng-Cheng;ZHAO Ping;HE Ying;YAN Gen-Qiang;LU Zhong-Xin

作者机构：中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部草食动物疫病重点开放实验室甘肃省生物检测工程技术研究中心 石河子大学动物科技学院 

出 版 物：《农业生物技术学报》 (Journal of Agricultural Biotechnology)

年 卷 期：2012年第20卷第3期

页      面：275-282页

核心收录：

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

基　　金：甘肃省科技支撑计划项目(No.1011NKCA054) 甘肃省农业生物技术专项(No.GNSW-2010-09) 国家科技基础性工作专项(No.2008FY210200) 国家现代肉羊产业技术体系(No.CARS-39) 

主　　题：绵羊肺炎支原体 pdha基因克隆 PDHA蛋白表达 免疫学活性 

摘      要：丙酮酸脱氢酶α-亚单位（PDHA）在病原体丙酮酸脱氢酶的催化过程中发挥着重要作用。为表达绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae）PDHA蛋白并测定其免疫学活性,应用PCR方法扩增出绵羊肺炎支原体pdha基因并对其序列进行分析,将pdha基因中色氨酸密码子TGA优化为TGG后进行全基因合成,插入到pET32-a（+）载体上,构建了pET32-a（+）-pdha重组质粒,将重组质粒转化到大肠杆菌（Escherichia coli）BL21中诱导表达PDHA蛋白,并通过免疫印迹及小鼠（Mus musculus）免疫试验对其免疫学活性进行测定。结果pdha基因全长1125bp,编码375aa,（G+C）%为34.76%,第304;06位、379;81位、586;88位、592;94位、625;27位、811;13位、889;91位及964;66位TGA在支原体中编码色氨酸而不是作为终止密码子;基因序列比对及进化树分析显示,绵羊肺炎支原体pdha基因与10种支原体的pdha基因序列同源性为32.6%;5.3%,氨基酸序列同源性为39.3%;0.6%,基因序列和氨基酸序列均与猪肺炎支原体（***）有同源性,分别为85.3%和90.6%;绵羊肺炎支原体pdha基因在33℃、IPTG0.25mmol/L诱导6h的表达条件下,表达量最高;重组的PDHA蛋白可与绵羊肺炎支原体高免血清具有免疫印迹条带,在免疫小鼠后血清抗体效价与对照组相比,均显著升高（P0.05）。本实验首次成功克隆表达了绵羊肺炎支原体pdha基因,并证明其重组PDHA蛋白具有较好的免疫学活性。为绵羊支原体肺炎基因工程疫苗及诊断研究提供候选靶标。