pEGFP-N1-BRCC3重组质粒的构建、鉴定及其表达

作     者：程芯育 钟海凤 徐绍业 张聪慧 韦睿妮 邵晓云 CHEN Xin -yu;ZHONG Hai-feng;XU Shao-ye;ZHANG Cong-hui;WEI Rui-ni;SHAO Xiao-yun

作者机构：桂林医学院研究生学院广西桂林541004 桂林医学院生物技术学院广西桂林541004 桂林医学院科学实验中心广西桂林541004 桂林医学院人体解剖学教研室、广西脑与认知神经科学重点实验室广西桂林541004 

出 版 物：《广东医学》 (Guangdong Medical Journal)

年 卷 期：2019年第40卷第19期

页      面：2705-2709页

学科分类：0710[理学-生物学] 1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 10[医学] 

基　　金：国家自然科学基金资助项目(编号:31660269) 广西自然科学基金青年基金项目(编号:2016GXNSFBA380098) 广西脑与认知神经科学重点实验室自由探索课题(编号:GKLBCN-20170107) 

主　　题：BRCC3基因 绿色荧光蛋白 基因重组 真核表达质粒 

摘      要：目的构建pEGFP-N1-BRCC3真核表达重组质粒,鉴定并检测其在HEK293细胞中的表达。方法根据去泛素化酶BRCC3(人的同源物称为BRCC36)基因cDNA克隆基因序列和表达载体增强绿色荧光蛋白真核表达载体(pEGFP-N1)质粒上的多克隆位点设计引物,利用RT-PCR从小鼠脑组织中提取BRCC3全长基因作为目的DNA片段,选择HindⅢ/SalⅠ内切酶将目的片段与pEGFP-N1真核表达载体进行双酶切,然后用T4连接酶连接,导入大肠杆菌经过转化、抗性筛选、质粒提取等过程获得融合的重组质粒,并再次双酶切电泳后初步筛选出可能正确的重组质粒,进而寄送公司进行DNA测序分析,通过DNAMAN软件比对,鉴定出目的基因BRCC3成功插入pEGFP-N1的重组质粒,以脂质体介导法转染HEK293细胞,通过Western blot检测BRCC3蛋白的表达。结果 DNA测序结果显示,pEGFP-N1-BRCC3重组质粒中目的DNA序列及方向完全正确,开放阅读框正确无误,表明重组pEGFP-N1-BRCC3质粒构建成功,将其转染HEK293细胞后,Western blot检测BRCC3蛋白表达明显增加。结论成功构建了pEGFP-N1-BRCC3真核表达重组质粒,并能在HEK293真核细胞中有效表达,为深入研究BRCC3基因在神经生物学领域的功能提供了实验基础。