细粒棘球绦虫磷酸甘油酸变位酶的表达、定位和诊断价值的初步评价

作     者：宋宏宇 梁雨晴 华瑞其 史媛 阳爱国 郭莉 袁东波 谢跃 杨光友 SONG Hong-yu;LIANG Yu-qing;HUA Rui-qi;SHI Yuan;YANG Ai-guo;GUO Li;YUAN Dong-bo;XIE Yue;YANG Guang-you

作者机构：四川农业大学动物医学院寄生虫病研究中心成都611130 四川省动物疫病预防控制中心成都610041 

出 版 物：《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》 (Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases)

年 卷 期：2020年第38卷第2期

页      面：194-200,206页

核心收录：

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

基　　金：四川省科技计划项目(No.2015NZ0041) 

主　　题：细粒棘球绦虫 磷酸甘油酸变位酶 原核表达 免疫定位 酶联免疫吸附试验 

摘      要：目的克隆、表达细粒棘球绦虫磷酸甘油酸变位酶(EgPGAM),分析其免疫反应性及其在原头节、包囊及成虫中的分布情况,对EgPGAM的诊断价值进行初步评价。方法提取细粒棘球蚴原头节RNA,逆转录为cDNA,PCR扩增EgPGAM基因,测序。通过多种生物信息学软件分析EgPGAM的理化性质、保守结构域、抗原表位和同源性等。利用Mega 5.0软件进行序列特征分析,采用邻接法构建系统进化树。将EgPGAM基因连接至pET32a表达载体,转入大肠埃希菌(***)BL21(DE3)中进行诱导表达,镍柱纯化,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析其表达情况并进行蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析。免疫荧光定位分析EgPGAM在原头节、包囊及成虫中的分布。采用ELISA评价EgPGAM的诊断价值。结果EgPGAM长756 bp,共编码251个氨基酸,编码蛋白的相对分子质量(Mr)约28000,等电点为8.29,不含信号肽,无跨膜区。EgPGAM含有12个高保守的氨基酸位点、3个保守的催化活性位点、1个底物结合位点和7个B抗原表位。EgPGAM的氨基酸序列与多房棘球绦虫、猪带绦虫、华支睾吸虫、秀丽隐杆线虫、人和羊的PGAM序列相似性分别为99%、94%、78%、45%、57%和4%。SDS-PAGE分析结果显示,EgPGAM在*** BL21(DE3)中大量表达,主要以可溶形式存在;Western blotting分析结果显示,EgPGAM可与感染细粒棘球蚴的绵羊血清发生反应。免疫荧光定位显示,EgPGAM主要分布在原头节表皮层和顶突沟,包囊生发层和成虫薄壁组织。建立的间接ELISA敏感性为55.6%(15/27),特异性为86.4%(89/103)。结论EgPGAM广泛分布于细粒棘球蚴和细粒棘球绦虫中,具有较好免疫反应性,但敏感性较低,不适合作为细粒棘球蚴病的候选诊断抗原。