诱生型NO合酶基因真核表达载体的构建

作     者：臧梦维 胡萍 刘枝俏 刘景生 彭学贤 

作者机构：中国医学科学院基础医学研究所中国协和医科大学基础医学院 中国科学院微生物研究所 

出 版 物：《基础医学与临床》 (Basic and Clinical Medicine)

年 卷 期：1997年第17卷第5期

页      面：42-50页

核心收录：

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

基　　金：国家自然科学基金 高等学校博士点基金 

主　　题：诱生型 一氧化氮合酶 分子克隆 基因表达 

摘      要：采用分子克隆技术，设计并构建来源ＲＡＷ２６４．７巨噬细胞ｉＮＯＳ基因ｃＤＮＡ的真核表达载体。以ＨｉｎｃⅡ＋ＮｏｔⅠ双酶解ｐＫＳｉＮＯＳ，电泳回收３９７３ｂｐ编码ｉＮＯＳ的ｃＤＮＡ序列，克隆入真核表达载体ｐＲｃ／ＣＭＶ的ＨｉｎｄⅢ和ＮｏｔⅠ位点。用ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ酶切鉴定，初步筛选２＃和８＃克隆为重组子ｐＣＭＶｉＮＯＳ。经ＮｏｔⅠ和ＫｐｎＩ＋Ｓａ１Ⅰ酶切结果表明，重组克隆外源ｉＮＯＳ基因插入位点和片段大小正确。以ＥｃｏＲＶ＋ＸｂａⅠ、ＥｃｏＲＶ＋ＳｃａⅠ、ＢａｍＨⅠ＋ＸｂａⅠ或ＢａｍＨⅠ＋ＢｇｌⅡ双酶切图谱分析，均证明ｉＮＯＳ基因正向插入真核表达载体。用ｉＮＯＳ基因特异性引物，ＰＣＲ分析质粒ｐＣＭＶｉＮＯＳ，扩增出４５１ｂｐ片段，提示重组质粒含有ｉＮＯＳ基因序列。ｐＣＭＶｉＮＯＳ特点是携有ｉＮＯＳ的ｃＤＮＡ序列，包括编码ｉＮＯＳ开放阅读框架，但删除５＇端部分非编码区，有利于高效表达。还含有巨细胞病毒强启动子、ｐｌｏｙ（Ａ）加接信号和ｎｅｏ标志基因，具有转染多种哺乳类细胞通用性。因此，重组表达质粒ｐＣＭＶｉＮＯＳ的构建可望为研究ｉＮＯＳ基因真核表达调控，阐明ＮＯ／ｉＮＯＳ调节神经、心血管和免疫系统的分子机理?