多糖蛋白结合疫苗中残留ADH和EDAC同时定量检测的液相色谱串联质谱法的建立

作     者：李茂光 龙珍 李亚南 王春娥 李月琪 毛琦琦 叶强 LI Mao-guang;LONG Zhen;LI Ya-nan;WANG Chun-e;LI Yue-qi;MAO Qi-qi;YE Qiang

作者机构：中国食品药品检定研究院卫生部生物技术产品检定方法及其标准化重点实验室北京102629 岛津企业管理(中国)有限公司北京100020 

出 版 物：《中国生物制品学杂志》 (Chinese Journal of Biologicals)

年 卷 期：2020年第33卷第9期

页      面：1054-1060页

学科分类：081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 

基　　金：国家科技重大专项“重大新药创制”(2018ZX09738-005) 

主　　题：液相色谱串联质谱 ADH EDAC 肺炎球菌结合疫苗 脑膜炎球菌结合疫苗 b型流感嗜血杆菌结合疫苗 

摘      要：目的建立同时定量检测己二酰肼(adipic acid dihydrazide,ADH)和N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺[N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodimide,EDAC]的液相色谱串联质谱(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)法,实现多糖蛋白结合物(肺炎球菌结合物、脑膜炎球菌结合物和b型流感嗜血杆菌结合物)中残留ADH和EDAC的定量研究。方法通过检测EDAC在纯水、中性水溶液[(50 mmol/L磷酸缓冲溶液(pH 6.8)、200 mmol/L氯化钠水溶液和疫苗培养基)]及0.1%甲酸(formic acid,FA)水溶液中的稳定性,确定实现EDAC完全转换为EDU的前处理条件。优化了色谱柱种类对ADH、EDU和EDAC的保留,以及质谱条件如产物离子、碰撞电压、Q1和Q3电压等对ADH和EDU定量灵敏度的影响,建立以C18WCX(2.1 mm×150 mm,5μm)为固定相,pH 2~3的0.1%FA-水和0.1%FA-乙腈为流动相的LC-MS/MS方法,实现ADH和EDAC(实际检测对象为EDAC的转换产物EDU)的高灵敏度定量分析。对建立方法的精密度、准确度、线性范围、检出限(LOD)和定量限(LOQ)进行验证。结果ADH在水溶液中较稳定,EDAC自溶解开始即水解为EDU,且难以完全转换,导致EDAC测定困难;在样品和标准品溶液中加入FA,可实现EDAC完全且快速的转换为EDU。ADH、EDU和EDAC在C18色谱柱上保留弱,在色谱柱的死时间附近出峰,无法实现这些化合物与样品基质的分离,而本文所选C18WCX固定相可实现目标化合物的保留且峰形较好。通过前体离子扫描、产物离子扫描,选择目标化合物的前体离子和响应强度较好的产物离子作为MRM的离子对,并用MRM自动优化程序获得目标化合物的最佳Q1、CE和Q3电压值。建立的方法检测的ADH和EDAC含量与峰面积线性关系良好,R2均大于0.999;ADH的LOD为3.96μg/L、LOQ为15.63μg/L,EDAC的LOD为0.58μg/L、LOQ为1.17μg/L,灵敏度较高;精密度(峰面积RSD2%)及准确度(回收率为90%~105%)较高。结论建立的LC-MS/MS方法实现了多糖蛋白结合疫苗中残留ADH和EDAC(通过测定EDU定量EDAC)的高灵敏度检测,与《中国药典》三部(2015版)方法相比,该方法预处理更简单,自动化程度更高且灵敏度更好,适合于多种多糖蛋白结合物中ADH和EDAC残留的检测。