新型2-甲氧基雌二醇衍生物抗肿瘤血管生成活性的研究

作     者：杨腾蛟 

作者单位：郑州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王淙

授予年度：2017年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100706[医学-药理学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：2-ME 抗血管新生 细胞迁移 毒副作用 

摘      要：目的研究2-ME及其衍生物的抗血管生成作用,从衍生物中,筛选具有抗血管生成活性好,并且毒性小的新型化合物,为临床上治疗癌症联合辅助用药提供研究依据。方法1.利用体内抗血管生成模型鸡胚尿囊膜法,筛选2-ME衍生物;2.采用MTT法检测筛选出的化合物GHY对多种细胞的细胞毒作用;3.采用划痕实验,检测化合物GHY在体外对HUVEC和MCF-7细胞的迁移的影响;4.运用Transwell小室迁移实验,检测化合物GHY对HUVEC和MCF-7细胞的迁移和侵袭的影响;5.采用Western blot法考察相关蛋白,确定化合物GHY抑制迁移侵袭作用的分子机制;6.利用裸鼠移植瘤实验,考察化合物体内抗肿瘤活性的研究,并检测血清中与肝功能相关的酶以及对内脏组织HE染色,评价化合物毒性。结果1.鸡胚尿囊膜实验结果显示,衍生物中GHY等化合物在血管数及血管面积上与对照组比较,具有统计学意义(P0.05)。2.用2-ME和化合物GHY分别处理HUVEC细胞、GES细胞、MCF-7细胞、MGC-803细胞、PC-3细胞48h和72h,MTT结果显示,2-ME对多种细胞均有细胞毒作用,而化合物GHY则未表现出明显的细胞毒作用,其中GHY对HUVEC细胞72h的IC50为66μM,而2-ME的72h IC50为2.11μM。3.对HUVEC细胞划痕实验和Transwell小室迁移实验结果显示,化合物GHY可以显著抑制血管内皮细胞的迁移,结果具有统计学差异(P0.05)。*** blot实验检测HUVEC细胞中有关蛋白的表达,包括VEGF-R、FAK、p-FAK、和SHC等。化合物GHY处理后,VEGF-R的蛋白表达下降,相应的SHC蛋白也减少,而FAK总蛋白不变,但FAK的活性形式p-FAK表达下调,最终抑制内皮细胞的转移。对蛋白表达量进行统计学分析,与对照组比较,GHY组具有统计学差异。***-7细胞划痕实验和Transwell小室迁移实验结果显示,化合物GHY可以显著抑制肿瘤细胞的迁移,并且呈浓度依赖性,结果具有统计学差异(P0.05)。6.在MCF-7细胞上,Western blot实验检测有关EMT标志蛋白的表达,结果显示,化合物GHY处理后,可以上调上皮表型标志物ZO-1和E-Cadherin蛋白的表达,同时下调间充质标志物N-Cadherin和Vimentin蛋白的表达。统计学分析蛋白量的表达,具有统计学差异(P0.05)。说明化合物GHY抑制MCF-7细胞迁移的机制可能通过抑制EMT过程。***-7细胞的裸鼠移植瘤实验结果显示,化合物GHY高剂量组可以抑制肿瘤体积和瘤重的增加,与对照组比较,具有统计学差异。表明,化合物GHY具有较好的体内抑制肿瘤生长的作用。8.通过生化学实验评价肝脏毒性以及各脏器的HE染色的病理切片结果表明,化合物GHY对ALT和ALP的值没有显著影响,而阳性对照5-FU组则表现一定的肝毒性。对AST的值,与对照组比较,有一些影响,但是都属于正常值范围内。内脏HE染色的病理表明,化合物GHY对内脏组织无明显可见的损害。因此,化合物GHY在体内也不表现明显毒性。结论综上所述,2-ME衍生物GHY可以明显的抑制体内血管的新生,并且具有较低的细胞毒作用,GHY可以显著的抑制HUVEC细胞的迁移,抑制HUVEC细胞的迁移的机制可能是通过抑制VEGFR通路中相关转移蛋白的表达来实现的。对于肿瘤细胞的作用方面,化合物GHY可以抑制肿瘤细胞MCF-7细胞的转移与侵袭,其机制可能是通过抑制EMT相关蛋白的表达来实现的。体内试验,GHY作用于MCF-7细胞裸鼠移植瘤,可以显著抑制瘤组织的生长,且无明显的毒性。