leT-7a miRNA在血管平滑肌细胞增殖及移植血管内膜增生中的作用及其机制研究

作     者：曹辉 

作者单位：中国医科大学 

学位级别：博士

导师姓名：胡新华

授予年度：2014年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：慢性动脉闭塞 血管平滑肌细胞 增殖机制 静脉移植术 内膜增生 let-7miRNA 

摘      要：前言 慢性动脉闭塞是老龄化病人一种常见的疾病，它往往导致间歇性跛行，静息痛和组织损伤。外周静脉移植术是解决动脉闭塞的优选方法，研究表明利用自体静脉改善通畅情况优于人工材料。虽然静脉移植术的起初疗效非常好，但是种种迹象表明由于内膜增生其移植血管的管腔会逐渐狭窄甚至闭塞。最近的研究表明，手术治疗的第一年内静脉移植的通畅率达85％-90％，然而十年内移植静脉再狭窄的发生率达50％。血管平滑肌细胞(VSMCs)的增殖是在内膜增生主要原因，这是早期移植静脉阻塞发病机制的关键。 miRNA是一种长度为18～25个核苷酸单链的内源性非编码性小RNA。它存在于多种生物的基因组中，包括从病毒到植物以及多细胞动物。miRNA最初是在线虫中发现的，现在的研究表明miRNA在大多数生物体基因表达中发挥关键作用。miRNA的功能是作为转录后调节剂，通过结合到靶mRNA调控基因的表达，参与多种生物学过程，进化过程相对保守。到目前为止，已经发现的人类基因组miRNAs超过1500个，根据研究估计60％以上的基因可以通过miRNA来调控。因此，这些小内源性沉默子作为关键调节剂出现在不同的生物学过程中，如细胞增殖，发育，血管新生，胆固醇代谢，肿瘤发生或细胞凋亡等。除了miRNAs基因表达调节剂的内源性生理作用外，细胞也可被动和/或主动释放miRNA，这种分子的旁分泌作用可以调节其他细胞的基因表达。因此，像癌症、代谢、脑疾病或动脉粥样硬化等疾病，都与miRNA的功能障碍有关。最近研究发现miRNA在血管疾病中也起着重要的作用，它通过调节脉管系统中参与细胞活动的关键的靶基因来发挥作用。let-7miRNA是最早发现的miRNA之一，在脊椎动物和无脊椎动物中高度表达。虽然let-7在血管系统也表达，但是其在VSMCs的增殖和移植血管中作用仍不清楚。在本研究中，通过微阵列基因芯片分析确定静脉移植模型的microRNA表达谱。并且通过实时定量聚合酶链反应（real-timePCR）方法进一步验证个别失调的miRNA。我们发现，let-7a在静脉移植模型中表达是下调。因此，我们推测，let-7a参与静脉移植术后内膜增生。在本研究中，我们发现let-7a在静脉移植模型中的潜在作用，以及let-7a抑制VMSC增殖的作用机制。 实验材料与方法 1、主要试剂 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠购买于中国医科大学实验动物中心;CCK-8（Dojindo公司，日本）、pluronicF-127和二甲基亚砜购买于sigma公司;DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶买于HyClone公司;下面是各种蛋白的抗体及其购买公司:α-SMA(Proteintech，Chicago，IL，USA)，PCNA（Proteintech公司，美国），K-Ras（Proteintech公司，美国）和c-Myc（Bioworld公司，美国），流式细胞增殖检测试剂盒购买BD公司。SP法免疫组织化学试剂盒、DAB显色液（福州迈新公司）;原位杂交试剂盒（博士德，中国）;Real-timePCR试剂盒（TaKaRa公司，日本）。let-7a慢病毒表达载体及其阴性对照购自上海吉玛制药技术有限司（病毒滴度1×108）。 2、动物模型 10％水合氯醛腹腔麻醉3ml/kg，显微镜下(SXP-1B)行无菌显微外科手术:取小鼠右侧颈总静脉长约4.5mm，肝素盐水冲洗后用11-0血管缝合线端-端吻合于肾下腹主动脉，术后分笼标记，由动物实验中心统一饲养。 3、基因筛查 提取组织中的总RNA，运用miRNA基因芯片筛查移植血管模型中差异性表达的miRNA，并通过real-timePCR进一步验证。 4、体内转染 以F-127为介质，将let-7amimics及阴性对照转染进入移植血管大鼠体内。实验分为四组:未处理组（untreated组）、凝胶组（Gel组）、阴性对照组(negativecontrols，NC组)、处理组(let-7amimics组) 5、real-timePCR检测let-7a的表达 Trizol法提取各实验组细胞总RNA，异丙醇浓缩RNA，分光光度计测定总RNA的纯度。取2μL总RNA，用OneStepPrimeScript(@)miRNAcDNASynthesisKit逆转录试剂盒按操作说明进行反转录反应。按照SYBRPremixExTaq荧光定量PCR试剂盒说明书进行PCR反应。 6、组织学分析 于术后28天取组织，福尔马林固定后包埋，进行HE染色和弹力纤维EVG染色，使用光学显微镜观察内膜增生的情况，并且测量内膜和中膜的比例。 7、免疫组化和原位杂交 石蜡切片行免疫组织化学检测α-SMA、PCNA、c-Myc与K-Ras的表达。原位杂交检测let-7a的表达。