高发、新发侵袭性酵母感染临床流行病学和早期诊断技术研究

作     者：方文捷 

作者单位：中国人民解放军海军军医大学 

学位级别：博士

导师姓名：廖万清;潘炜华

授予年度：2018年

学科分类：1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 100401[医学-流行病与卫生统计学] 10[医学] 

主      题：念珠菌 隐球菌 临床流行病学 侵袭性真菌病 分子诊断 PCR 

摘      要：【研究目的】侵袭性酵母感染占所有真菌感染的90%以上,引起包括念珠菌病、隐球菌病和毛孢子菌病在内的多种严重真菌病。一方面,临床对于高发、新发致病酵母感染的流行病学和临床特征缺乏认识。侵袭性酵母感染病原谱的不断变迁,以往不致病或者较少致病的酵母感染病例逐年增多,同时传统高发病的酵母感染逐渐累及新的的基础病群体。比如,念珠菌属的多种非致病菌(如Candida auris,Candida fabianii)近年来逐渐成为致病菌,有些甚至发生了暴发流行,但是其流行病学、临床特征和干预策略的相关研究仍然较为滞后。又如,虽然国际上对于隐球菌脑膜炎的临床研究日益增多,但是目前对于隐球菌病的临床流行病学研究主要集中于HIV阳性人群。临床研究工作者较少从其他免疫状态人群入手,对该类患者的临床特征和诊疗策略进行系统的、分类的分析;由于缺乏临床证据,国际指南暂缺乏对不同免疫状态人群的特异性临床干预策略。据此,本研究的第一、二、三、四、五、六部分旨在填补新发、高发侵袭性真菌感染临床流行病学方面相应的空白。另一方面,由于侵袭性酵母感染病原谱的不断变迁,将微生物鉴定到菌种水平显得愈发重要,故传统诊断技术的局限性日益显现。本研究第七、八、九、十部分利用分子诊断的方法,重点针对以下三个方面开发诊断新技术:1、开发一套诊断策略,可以精准、低成本实现95%以上酵母感染的诊断;2、开发一套针对9个最常见医学相关念珠菌隐匿种的鉴别方法,用于解释90%左右的念珠菌感染;3、针对耳道念珠菌及其近缘种,实现通量高、敏感度高、特异性好、低成本分子诊断方案。【研究方法】本系列研究第一、二、三、四、五、六部分的临床数据来源于上海长征医院、上海长海医院、伊朗设拉子大学医学科学院及9个国内外医学文献数据库。使用预先设计的表单,使用EPIDATA等软件抽取临床数据。在统计分析上,我们运用卡方检验分析分类变量;多重回归分析用于确定患者预后的独立预测因子;单个率合并分析用于确定全球患病率。本系列研究第七、八、九、十部分属于分子诊断体系研发。所用参考菌株来自全球最大的菌种保藏和医学真菌研究中心Westerdijk Fungal Biodiversity Institute,临床菌株来自中国、伊朗,科威特和奥地利多家医院。靶标序列来自本研究所内部数据库以及Genbank。序列分析和引物设计使用Geneious?10.1.2软件。体系以参考菌株优化并完成特异性试验后,进一步利用临床菌株体系扩大验证,并同MALDI-TOF MS和一代测序鉴定结果平行比较。【结果】第一部分研究发现:目前全球62.9%的结核/隐球菌共感染病例发表于我国(n=197),56.3%的我国病例发表于2010年之后;99.5%的病例分布于我国季风区。在临床表现上,HIV阳性患者伴发结核/隐球菌共感染的症状比HIV阴性患者更加严重。在诊断方面,几乎所有的结核性脑膜炎合并隐球菌脑膜炎病例均经历误诊或者漏诊(95.2%)。为了解决这一诊断难题,本研究首次提出“联合应用颅内压和脑脊液糖、蛋白、氯的联合诊断策略,该策略可有效区分结核性脑膜炎单独感染、隐球菌性脑膜炎单独感染以及结核/隐球菌脑膜炎共感染(AUC=0.89),同时不增加患者经济负担。第二部分研究发现:在SLE人群中,隐球菌脑膜炎的患病率为0.5%。患者主要以成人女性为主。感染前激素治疗剂量大于30?mg/day泼尼松当量同高死亡率相关(OR=9.69(1.54,60.73))。36.8-38.9%患者在隐球菌脑膜炎发病过程中,狼疮活动呈现较低水平,感染发生较为隐匿。该疾病总误诊率为38.2%,死亡率为23.6%。第三部分研究发现:在SLE病程中,狼疮脑病发生时间早于隐球菌脑膜炎(p=0.03)。除发热,头痛和颈部僵硬外,大多数临床表现无法区分两个疾病状态(p0.7)。第四部分研究发现:II型糖尿病隐球菌患病率为0.21%。此类患者平均年龄为56.1岁(95%CI:51.5,60.6),93%的患者年龄大于40岁。感染前62%的患者未经糖尿病管理或血糖控制不良。MLST分型示所有临床菌株属于ST5型,抗真菌药敏试验未发现耐药菌株。69%肺隐球菌病患者经历误诊误治,60%隐球菌脑膜炎患者接受不标准的抗真菌治疗。总体死亡率为33%。第五部分研究发现:肾病综合征患者中隐球菌病的患病率为0.3%。从肾病综合征确诊到隐球菌病确诊的中位时间间隔为16个月。46%隐球菌病发生于肾病综合征确诊第一年内。皮肤隐球菌病占所有类型隐球菌病的比例较高(35%)。58%患者经历了误诊误治,误诊病例中90%被初诊为细菌感染。总体死亡率为35%。第六部分研究