重组MICA 08蛋白制备及其预存抗体对大鼠肾移植的影响

作     者：李恩春 

作者单位：苏州大学 

学位级别：博士

导师姓名：侯建全;何军

授予年度：2012年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：昆虫-杆状病毒表达系统 重组MICA蛋白 预存MICA抗体 肾移植 大鼠 利妥昔单抗 

摘      要：肾移植后随着新型针对T细胞强效免疫抑制剂的广泛联合应用，使急性细胞性排斥反应得到了很好的控制，也大大减少了早期移植肾的丢失。然而，近年研究表明移植肾长期存活并没有随之得到很好改善，这使人们开始重视HLA（Human leukocyteantigen，HLA）抗体介导的急、慢性体液性排斥反应对移植肾长期存活的意义。尽管在抗体介导排斥反应中，多数情况是由于HLA抗体的缘故，但在一些HLA抗体阴性的患者中也发生了肾移植失功，这表明除HLA抗体外还存在其它抗体也介导移植肾失功。 主要组织相容性复合物-Ⅰ类相关链A（Major histocompatibility complex classI–related chain A，MICA）基因位于人第6号染色体的MHC-I类区域中，具有高度多态性，其编码MICA分子表达在内皮细胞表面。功能上MICA分子不结合β2微球蛋白，缺乏与CD8受体特定结合的残基，没有抗原肽递呈能力；其系通过与NKG2D（Naturalkilling cells receptor G2D，NKG2D）受体结合实现生物学功能。NKG2D是为NK细胞活化性受体，除表达于NK细胞外，还表达在γδT、CD8+T细胞上。MICA分子与NKG2D结合后不仅能激活NK细胞和T细胞毒性作用，分泌大量细胞因子及细胞毒介质，造成移植物破坏；而且能促使B细胞产生相应MICA抗体，参与体液免疫应答。 由于MICA分子通常不表达在淋巴细胞表面，在肾移植时通常采用的淋巴细胞交叉反应无法检测到MICA抗体。近年随着MICA抗体检测技术的进步，多个器官移植中心在移植受者、排斥反应前、发生排斥反应切除的移植物中及其洗脱液中都检测到MICA抗体，使MICA抗体的体液免疫作用备受关注，成为移植免疫研究的热点。一系列研究表明，MICA抗体与排斥反应相关，对移植物的长期存活存在负面效应，这种负面效应在HLA良好配型无或少量HLA抗体的受体中更为明显。虽然有研究认为MICA抗体可以通过补体依赖的细胞毒途径造成内皮细胞损伤，引起移植物失功；但对MICA抗体引起急、慢性排斥反应的确切分子免疫作用机制及系统干预措施目前仍不十分清楚，也缺乏特异性MICA抗体介导的体液性排斥反应动物模型相关方面研究。 因此，我们设想采用蛋白重组技术制备具有免疫活性的重组MICA08蛋白免疫大鼠，建立预存特异性MICA抗体动物模型。通过对预存特异性MICA抗体动物进行肾移植诱导建立特异性MICA抗体介导的排斥反应并观察其对大鼠移植肾的影响，探讨新型免疫剂利妥昔单抗在干预MICA抗体介导的排斥反应中的价值。研究分三个部分： 第一部分：应用昆虫-杆状病毒表达系统制备重组MICA08蛋白 目的：应用昆虫-杆状病毒表达系统在昆虫细胞(Sf-9)中表达人MICA﹡008胞外结构域。 方法：采用昆虫-杆状病毒表达系统，构建重组转移载体pFastBac-MICA﹡008，并将其转化到E. coliDH10Bac感受态细胞中进行转座，通过蓝白斑筛选和测序鉴定后，获得重组杆状病毒Bacmid-MICA﹡008；应用脂质体转染Sf9细胞进行目的蛋白表达，并对表达产物进行镍柱亲和层析纯化、Western blot和考马斯亮兰染色鉴定。结果：在重组病毒感染第四天后收集P3代病毒上清液，P3代上清液经镍柱亲和层析纯化，最后获得纯化重组MICA08蛋白量约为1.4-1.5mg/L。纯化MICA08蛋白经Westernblot和考马斯亮蓝染色鉴定，可见一条分子量约为37kDa的特异性条带与目的蛋白大小相符。 结论：应用昆虫-杆状病毒表达系统可在昆虫细胞中成功表达重组人MICA08蛋白，为下步预存抗体模型的建立奠定了物质基础。 第二部分显微外科微血管吻合技能训练及大鼠原位肾移植模型建立目的：探讨快速建立大鼠原位肾移植模型的显微外科训练方法，为开展肾移植基础研究奠定基础。 方法：设计并实施循序渐进式显微外科训练项目，以快速突破微血管吻合技术瓶颈。训练项目包括镜下纱布缝合、大鼠颈动脉吻合、大鼠股血管吻合及大鼠尾动脉吻合训练。然后采用30例同系SD大鼠供体双肾切除原位移植训练积累手术经验，克服学习曲线；术中肾血管重建采用端-端吻合法，尿路重建运用膀胱瓣技术或输尿管-输尿管端端吻合。模型稳定后，再行20例SD→Wistar大鼠异系移植建立急性排斥反应模型，并将其随机分排斥组和MMF治疗组，MMF治疗组给予MMF20mg/kg/d灌胃，×10d。在术后第3d、7d、14d、21d采血，行血清肌酐检测。结果：通过2个月强化显微外科培训，完成了200根以上微血管吻合练习，大鼠肾移植模型趋于稳定，术后一周成活率达90%。在行20例异系移植中，平均手术时间为72.9±4.18min，