翘嘴鳜肌纤维初步分型及其红肌sMyHC1基因克隆、表达分析

作     者：刘希良 

作者单位：广西师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宾石玉;褚武英

授予年度：2013年

学科分类：0908[农学-水产] 09[农学] 

主      题：翘嘴鳜 肌纤维 苏木精-伊红染色 琥珀酸脱氢酶 肌球蛋白三磷酸腺苷酶 红肌肌球蛋白重链1 

摘      要：翘嘴鳜（Siniperca chuatsi）是我国名贵的淡水经济鱼类,肉质细嫩,营养丰富,已成为水产养殖的重要品种。为了探讨翘嘴鳜肌纤维的分型及其红肌肌球蛋白MyHC1基因的克隆表达,本研究以500g成年翘嘴鳜为试验动物,进行了三个试验,在对翘嘴鳜背侧沿纵轴前、中、后肌肉组织石蜡切片苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosinstaining, HE）比较观察的基础上,进行了背肌冷冻切片、琥珀酸脱氢酶（SDH）和肌球蛋白腺苷三磷酸酶（mATPase）染色分型分析,对红肌肌球蛋白sMyHC1基因进行了克隆与表达分析,为深入研究翘嘴鳜肌纤维分子分型奠定基础。 1.翘嘴鳜背肌石蜡切片HE分型研究 本试验采用石蜡切片、苏木精-伊红染色（HE）和Image-Pro图像分析软件,研究翘嘴鳜背肌纤维分型。结果表明,背肌浅层肌纤维细胞边缘圆润,肌纤维直径在0～15μm的比例,前、中和后部分别为3.37%、5.14%和7.10%,后部显著高于前部（P0.01）和中部（P0.05）,中部显著高于前部（P0.05）；肌纤维直径在15～30μm的比例较多,后部为71.43%,显著高于前部的64.36%（P0.05）和中部的64.20%（P0.05）；肌纤维直径在30～45μm的比例,中部显著高于后部（P0.05）,肌纤维直径大于45μm的比例,前部显著高于中部（P0.05）和后部（P0.01）。背肌深层肌纤维细胞呈棱角多边形,肌纤维直径在0～40μm的比例,后部为39.77%,显著高于前部的35.33%（P0.05）和中部29.47%（P0.01）,前部显著高于中部（P0.05）；肌纤维直径在40～80μm的比例较多,中部为64.10%,显著高于前部的55.83%（P0.05）,高于后部的58.23%；肌纤维直径在80～100μm的比例较少,前部为7.20%,显著高于中部的4.7%（P0.05）和后部的2.60%（P0.01）,在后部未发现直径大于100μm的细胞。 2.翘嘴鳜背肌琥珀酸脱氢酶和肌球蛋白腺苷三磷酸酶染色分型研究 本试验应用冰冻切片技术、琥珀酸脱氢酶（SDH）和肌球蛋白腺苷三磷酸酶（mATPase）染色法,观察比较各型肌纤维的组织化学特性,研究翘嘴鳜背肌纤维分型、构成比例与分布。结果表明,根据SDH酶组织化学实验可以将翘嘴鳜的肌纤维分成三类,第一类为深染蓝紫色、有氧代谢型的慢肌（红肌）纤维,第二类为浅染蓝紫色、兼有氧代谢型的中间肌纤维,第三类为基本不着色、无氧代谢型的快肌（白肌）纤维。分析红白肌纤维各直径大小范围的肌纤维细胞所占比例以及分布位置,发现两者分别与石蜡切片HE染色中区分出的浅层肌和深层肌一一对应；在白肌纤维中有一种小于40μm的细胞具有琥珀酸脱氢酶活性能染上蓝色,占25.01%。通过不同的pH下的预孵育液处理进行mATPase组织化学实验可以将翘嘴鳜的肌纤维分为Ⅰ型（慢速氧化型）、Ⅱa型（快速氧化型）和Ⅱb（快速酵解型）三类,分别占总纤维的7.50%、14.07%和78.43%。Ⅰ型为酸稳定肌纤维,直径在12.62-42.53μm之间；Ⅱ型纤维为碱稳定肌纤维,其中Ⅱa型直径在20.35-37.47μm, Ⅱb直径在47.61～103.45μm, Ⅱ a型可能是白肌中能染成蓝色的小纤维。 3.翘嘴鳜红肌sMyHC1基因克隆与表达分析 本研究根据翘嘴鳜红肌转录组数据库中翘嘴鳜红肌肌球蛋白重链1（sMyHC1）基因部分序列,采用cDNA末端扩增技术（RACE）得到sMyHC1基因编码区和3’端序列。sMyHC1基因cDNA序列长为5940bp,编码区长度为5823bp,编码1940个氨基酸,其分子量约为223630.68道尔顿,等电点为5.58。sMyHC1主要包含两个保守结构域：MYSc_type1I和Myosin_tail1。构建的鱼类肌球蛋白重链系统发育树显示其主要分为两大支：白肌一支,红肌和心肌一支,其中sMyHC1归类于红肌一支,并和红鳍东方鲀红肌肌球蛋白重链基因MyHCm8248在同一小支上。采用实时荧光定量PCR方法分析sMyHC1在翘嘴鳜白肌、红肌和心肌中的差异表达,发现该基因在红肌和心肌中的表达显著高于白肌（P0.05）。