宫颈癌干细胞的分选及放疗抵抗机制的研究

作     者：刘红 

作者单位：河北医科大学 

学位级别：博士

导师姓名：程建新

授予年度：2016年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：宫颈癌干细胞 放射抵抗 细胞凋亡 转移 复发 上皮细胞间质转化 

摘      要：宫颈癌是女性生殖系统最高发的恶性肿瘤之一,全世界每年有将近30万的患者死于宫颈癌,我国宫颈癌的发病率位居世界第二。目前,宫颈癌的治疗方法主要有手术、放疗和化疗三种。放射治疗因其广泛的适应症而成为宫颈癌治疗的重要方法。除患者存在严重的肝肾功能损伤以及造血功能障碍外,各期宫颈癌患者均可接受放射治疗,对于中晚期、复发或者无法手术的患者,放射治疗则为首选。然而,由于患者个体体质的差异以及肿瘤的异质性,不同患者对放射治疗的反应不同,存在放疗敏感性和放疗耐受性差异,导致放疗的效果不同。据统计,有大约30～50%的宫颈癌患者在最初治疗结束后3年至5年内会面临复发和转移。有研究表明,放疗耐受是宫颈癌治疗失败并出现复发转移的重要原因。然而,到目前为止,产生放疗抗拒的机制尚不明确。如果能够阐明宫颈癌放疗耐受性的机制不仅可为宫颈癌个体化治疗的设计提供理论依据,也可为开发逆转宫颈癌放疗耐受的治疗手段提供新的思路,因此具有重要的理论意义和实际应用价值。目前认为肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSC)是肿瘤组织中数量极少的一部分细胞,具备自我更新和多向分化潜能,以及表达干细胞表面标志物等特性。研究表明,在多种实体瘤包括宫颈癌中已经发现有肿瘤干细胞存在。但是何为宫颈癌干细胞的表面标志物尚未明确,因此,有关明确宫颈癌干细胞的表面标志物及如何分离和鉴定宫颈癌干细胞方面的研究一直备受关注。上皮间质转化(Epithelial–mesenchymal transition,EMT)是指上皮表型与细胞粘附分子表达的缺失,同时获得间质分子、成纤维细胞或间充质细胞表型及迁移能力。肿瘤细胞可以通过EMT的形式向间质细胞转化,侵入淋巴管和血管,从而发生转移。在种植部位,癌细胞还可通过间质细胞向上皮细胞转化(mesenchymal–epithelial transition,MET)重建细胞骨架及细胞间的粘附复合体,形成转移灶。与EMT相关的信号转导通路可以增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力和抗凋亡能力。越来越多的研究表明在肿瘤细胞放疗抵抗和获得emt分子表型间存在关联,而肿瘤干细胞的特点之一就是可以分化为具备emt表型的肿瘤细胞,因此与emt相关的肿瘤放疗抵抗可能与肿瘤干细胞密切相关。宫颈癌患者出现治疗后局部的复发和远处的转移,其原因主要是由于放疗抵抗。我们实验发现放疗抵抗的宫颈癌细胞中富集cd44+/cd24+表达阳性的宫颈癌细胞,因此推测cd44+/cd24+表达阳性的宫颈癌细胞具备抗拒放疗及部分干细胞的特性,并经历emt过程。基于上述分析以及预实验的结果,本论文拟对cd44+/cd24+表达阳性的细胞的放疗抵抗性、是否具备肿瘤干细胞特性以及其与宫颈癌复发转移的关系进行深入研究,旨在阐明宫颈癌放疗抵抗的机制,为临床上宫颈癌的个体化治疗提供理论基础。主要研究内容如下:第一部分cd44+/cd24+表达阳性的宫颈癌干细胞样特性的研究目的:探讨放疗抵抗的宫颈癌细胞的特性,揭示宫颈癌复发和转移的原因。方法:用多次分割照射获得耐放疗的宫颈鳞状细胞癌siha细胞,利用流式细胞仪从宫颈鳞癌的亲代细胞中分选获得cd44+/cd24+表达阳性的宫颈鳞癌细胞;将耐放疗的宫颈鳞癌细胞和cd44+/cd24+表达阳性的宫颈鳞癌细胞设为实验组,亲代宫颈鳞癌细胞设为对照组,分别进行克隆形成试验和肿瘤移植瘤试验,评估试验组细胞是否具备肿瘤干细胞特性;通过transwell侵袭试验研究实验组及对照组细胞侵袭和转移能力的差异;利用rt-pcr和western试验检测实验组及对照组细胞oct-4、survivin、abcg2和bcl-2mrna的表达,以及与肿瘤转移相关的e-cadherin和vimentin蛋白表达;应用spss11.5软件包进行统计学分析。实验数据以均数±标准差表示,计量资料进行t检验,以α=0.05为水准,p0.05为差异有统计学意义。结果:放疗抵抗的宫颈鳞癌细胞和cd44+/cd24+表达阳性的宫颈鳞癌细胞高表达抗凋亡蛋白bcl-2和凋亡阻抑蛋白survivin,并表达肿瘤干细胞相关标志物oct4和abcg2。两实验组细胞均具有较强的致瘤能力以及侵袭和转移能力,且表现出e-cadherin下调和vimentin蛋白上调的emt相关的分子表型变化。统计学结果显示,实验组与对照组间比较差异显著(p0.05)。结论:放疗抵抗的宫颈鳞癌细胞与cd44+/cd24+表达阳性的宫颈鳞癌细胞表现出相同的肿瘤干细胞特性,经历了emt过程,放疗可以富集宫颈癌干细胞。第二部分cd44+/cd24+表达阳性的宫颈癌细胞放疗抵抗机制的研究目的:探讨cd44+/cd24+表达阳性的宫颈鳞癌细胞的放射敏感性及其抗拒放疗机制。方法:体外培养人宫颈鳞癌siha细胞,采用流式细胞分选仪分选出cd44+/