2型糖尿病血瘀证血管内皮细胞损伤模型的研究

作     者：周永红 

作者单位：暨南大学 

学位级别：博士

导师姓名：陈利国

授予年度：2008年

学科分类：100506[医学-中医内科学] 1006[医学-中西医结合] 1005[医学-中医学] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：糖尿病 血瘀证 病证结合 细胞损伤模型 

摘      要：研究目的 建立2型糖尿病血瘀证的血管内皮细胞损伤模型,为中医学病证结合细胞模型的研究提供方法学上的借鉴。实验内容包括两部分,第一部分进行糖尿病血瘀证血管内皮细胞损伤模型的研究,体现“同病异证的特点;第二部分进行高血压病血瘀证和糖尿病血瘀证细胞损伤模型的比较研究,探讨“异病同证的差异。 第一部分2型糖尿病血瘀证血管内皮细胞损伤模型的研究 实验1.2型糖尿病血瘀证患者血清对人脐静脉内皮细胞(ECV-304)的细胞活性和形态的影响 目的:观察2型糖尿病血瘀证患者血清对人脐静脉内皮细胞(ECV-304)的细胞活性和细胞形态的影响。 方法:ECV-304传代后取对数生长期细胞干预分组如下:N组(正常对照组)、H组(健康人血清干预)、MD组(糖尿病血瘀证患者血清干预)和MND组(糖尿病非血瘀证患者血清干预)。其中糖尿病血瘀证和非血瘀证患者血清各有3个浓度:5%,10%,20%。采用MTT法在全自动酶标仪上于570nm处测定吸光值,应用倒置相差显微镜、扫描电镜和透射电镜观察细胞形态的变化。 结果:①MTT法检测细胞活性,5%浓度:MD组的OD值(0.94±0.14)较H组(1.60±0.17)明显降低,差异有统计学意义(P0.001);10%浓度:MD组的OD值(0.88±0.11)较H组(1.34±0.14)明显降低,差异有统计学意义(P0.001)。②电镜下MD组细胞和N组的细胞形态上具有明显差异。倒置相差显微镜观察发现:MD组的细胞由圆形居多变为多角形或椭圆形居多,伴间隙增宽;扫描电镜观察发现:MD组细胞收缩分离成为放射星状体,细胞表面有大小不一的圆形凹陷或突起;透射电镜观察发现:MD组胞浆内所含的吞饮泡较N组多,粗面内质网扩张伴数目减少,核糖体部分丢失。平面内质网明显扩张,线粒体肿胀,嵴消失。 结论:10%浓度的2型糖尿病血瘀证患者血清严重损伤体外培养的正常人脐静脉内皮细胞(ECV-304),造成细胞活性降低和细胞形态改变。 实验2.2型糖尿病血瘀证患者血清对人脐静脉内皮细胞(ECV-304)内分泌功能的影响 目的:观察2型糖尿病血瘀证患者血清干预ECV-304对其内分泌功能的影响。 方法:细胞干预分组方法同实验1。应用放免法测定内皮素(ET)含量,应用硝酸还原酶测定一氧化氮(NO)含量;利用双抗夹心ELISA法检测各组细胞培养上清液中内皮细胞蛋白C受体(EPCR)、血管内假性血友病因子(vWF)和血栓调节蛋白(TM)的含量。 结果:①MD组的ET水平(286.03±24.03)比N组(77.88±10.07)升高,差异有统计学意义(P0.001);MD组的ET水平(286.03±24.03)比MND组(236.22±15.89)升高,差异有统计学意义(P0.001)。②MD组的NO水平(22.37±3.30)比N组(52.97±8.51)降低,差异有统计学意义(P0.001);MD组的NO水平(22.37±3.30)和MND组(24.55±3.79)相比差异没有统计学意义(P0.05)。③内皮细胞经过患者血清损伤后,MD组分泌的EPCR含量(189.66±11.76)比N组(113.94±16.04)升高,差异有统计学意义(P0.001);MND组分泌量(216.24±15.86)较MD组(189.66±11.76)升高,差异有统计学意义(P0.001)。④损伤后MD组分泌的vWF含量(79.94±8.52)比N组(51.09±9.92)升高,差异有统计学意义(P0.001);MND组分泌量(78.85±10.17)较MD组(79.94±8.52)减少,但差异没有统计学意义(P0.05)。⑤损伤后MD组分泌的TM含量(29.25±5.16)比N组的(18.47±2.59)升高,差异有统计学意义(P0.001);MND组分泌量(26.40±4.36)较MD组(29.25+5.16)减少,但差异没有统计学意义(P0.05)。 结论:糖尿病血瘀证患者血清干预ECV-304后可以造成血管内皮细胞功能损伤,表现在内分泌功能的变化上,其中最为明显的是释放ET增加,而NO分泌减少,ET和NO二者之间失去平衡;反映内皮细胞内分泌功能的细胞因子如EPCR、vWF和TM等细胞损伤标志物的含量也显著上升,尤其是EPCR增加最为明显,提示糖尿病血瘀证患者血清对上述因子的表达起作用,说明糖尿病血瘀证患者血清干预正常的血管内皮细胞,可以造成内分泌功能紊乱。 实验3.2型糖尿病血瘀证患者血清对人脐静脉内皮细胞(ECV-304)骨架及胞浆内游离钙的影响 目的:探讨2型糖尿病血瘀证患者血清干预ECV-304对细胞骨架微丝及胞浆