洛沙坦对高氧致CLD新生大鼠肺纤维化影响的实验研究

作     者：陈宁 

作者单位：中国医科大学 

学位级别：博士

导师姓名：薛辛东

授予年度：2007年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100202[医学-儿科学] 10[医学] 

主      题：早产儿 慢性肺疾病 高氧 胶原 α-平滑肌肌动蛋白 血管紧张素Ⅱ 血管紧张素Ⅱ1型受体 洛沙坦 基质金属蛋白酶 基质金属蛋白酶抑制剂 

摘      要：前言 早产儿慢性肺疾病（CLD）是早产儿在肺发育未成熟的基础上，因高氧、感染，气压伤等原因引起肺部的远期合并症。早产儿CLD作为早产儿肺透明膜病治疗的并发症在1967年首次被Northway描述，也称为支气管肺发育不良（BPD）。氧疗法是患有心肺疾病的早产儿最常应用的一种治疗手段。这一措施虽可改变患儿的低血氧状态、挽救患儿的生命，但长期吸入高浓度的氧气，可引起不同程度的肺损伤，严重者可发展为CLD。随着新生儿医学的不断发展，重症抢救技术水平的提高，使得CLD的发病率呈逐渐增高趋势（30％～40％）。由于目前尚无有效的预防和治疗方法。高氧后早产儿CLD已成为NICU最为棘手的问题之一。 目前CLD发生机制的研究已成为国内外研究的热点之一，虽然大量临床和动物实验从氧化应激性肺损伤、炎症反应、细胞凋亡和某些生长因子不足介导的肺发育障碍等诸多角度阐明了CLD的发生和发展过程，但其确切的发生机制仍不详。不论病因如何，CLD的特征性病理改变是肺发育受阻和肺间质纤维化。早产儿CLD目前尚无有效的治疗方法，早在上世纪90年代糖皮质激素是预防和治疗的治疗早产儿CLD的常规用药，用来减轻肺水肿、局部炎症反应并减少患者对氧的依赖程度，但越来越多临床研究表明：糖皮质激素影响肺分支发育、脑发育和体格发育，已很少应用。早期预防性应用表面活性物质替代疗法可改善肺功能，但不能降低CLD的发病率。因此研究其发病机制，寻求如何逆转高氧诱导的肺泡发育阻滞、减轻肺间质广泛纤维化、减少新生儿CLD发生成为新生儿医生面临的一个紧迫待解决的课题。 血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）是作用于血管的辛肽化合物，由于其通过收缩血管和钠潴留来控制血压和容量自体稳定而一直受到关注。研究发现，在许多组织中存在局部的RAS能独立于循环系统产生AngⅡ的前体，并发现AngⅡ在组织损伤、纤维化过程中可能扮演重要的角色。体外实验证实AngⅡ通过AT1R促进培养的肺泡上皮细胞（AEC）调亡；刺激肺FB自分泌TGF-β1进而促进FB增殖和分化、胶原沉积；还有人认为AngⅡ可能通过与AT1R结合通过调控MMPs/TIMPs的合成及活化、参与组织重塑的过程；另外肺循环或肺实质内激活的局部RAS系统还能通过增加血管渗透性、增加血管紧张度等多个机制参与肺损伤的发生。应用ACEI和AT1R拮抗剂能够减轻博莱霉素诱导肺纤维化的进展。推测肺局部的RAS在肺纤维化发病过程中具有重要的作用。 关于RAS系统在高氧致新生大鼠CLD发病中的作用研究尚少。Li研究发现在高氧刺激后新生大鼠肺组织中AngⅡ和ACE水平上升，并且应用开博通可减轻肺纤维化。但其确切机制不清。本研究计划将新生鼠暴露于85％高氧环境发病中，制造CLD的动物模型，同时给特异性AT1R拮抗剂losartan干预，通过组织病理、形态学分析并且进一步从蛋白、基因水平等方法进行检测，从肺局部RAS的受体水平来研究在高氧致新生大鼠CLD发病机制，探讨losartan抗肺纤维化可能的作用机制，为寻求早产儿CLD的治疗提供新思路。 实验材料与方法 一、动物模型 本实验是在中国医科大学盛京医院实验动物中心完成。足月新生Wistar大鼠（连同母鼠）被随机分为4组：AIR组、空气对照组；O2组、单纯高氧暴露组；AO2组、高氧+注射用水组；LO2组、高氧+losartan组。将2-4组在生后24 h内置于玻璃氧舱中，持续输入氧气，维持在FiO2 0.85，每日两次监测氧浓度（美国OM-25ME型测氧仪监测），用钙石灰吸收CO2，使其浓度小于0.5％（美国Dapex气体分析仪），温度20℃～25℃，湿度50％～70％，每天开箱0.5h，称重，添加水及饲料，更换垫料，与空气组互换母鼠以避免母鼠因氧中毒而致护理能力降低；空气对照组置于空气中（FiO2 0.21），饲养条件与高氧组相同。3、4组于生后6d每天分别经胃管灌服注射用水（3ml/kg）、losartan（5mg/kg/d，注射用水3ml/kg配成混悬液），直至实验结束。 二、标本采集和处理 每组分别于实验开始后的第1、3、7、14、21天分别从中随机抽取8只，腹腔注射5％水合氯醛6ml/kg麻醉后处死。立即打开胸腔，无菌条件下分离肺组织，取右肺各叶置于无Rnase的Eppendorf管中于-80℃冰箱中保存。取左肺置于0.1％DEPC的4％多聚甲醛（0.1MPBS，pH7.0～7.6）固定，常规脱水、石蜡包埋。 三、实验方法 （一）、一般状况观察 动态观察各组新生大鼠的一般状态和死亡情况、监测体重，并比较时点生存率和生存曲线。