水稻白叶枯病菌c-di-GMP信号受体Filp和PXO02374的互作蛋白鉴定

作     者：李潇桐 

作者单位：中国农业科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：何晨阳

授予年度：2014年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：水稻白叶枯病菌 c-di-GMP 受体 互作蛋白 毒性调控 

摘      要：在与寄主水稻互作中，水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae,简称Xoo）通过多种信号途径调控其毒性和侵染过程。环鸟苷二磷酸（cyclic-diguanylate,简称c-di-GMP）是细菌内普遍存在的第二信使，参与细菌体内信号级联反应，调控细菌毒性、生物膜形成、胞外多糖产生和运动性等生物学功能。c-di-GMP受体作为信号识别、接收和传递者，可在基因转录、翻译和翻译后等水平上发挥调控功能。前期研究表明，Xoo菌株PXO99A具有26个c-di-GMP信号代谢相关蛋白，c-di-GMP水平变化影响致病性和EPS产生，说明c-di-GMP信号系统在Xoo毒性调控中至关重要。两种c-di-GMP信号受体Filp （含有退化的GGDEF和EAL结构域）和PXO02374（含有PilZ结构域）参与了Xoo毒性表达的调控，但是对其介导的下游调控途径及其机理尚不清楚。因此，本研究对Filp和PXO02374的互作蛋白进行了筛选，鉴定了互作模式，为阐明c-di-GMP信号在Xoo毒性调控中的作用机理提供了科学依据。主要结果如下： 1. Filp与PXO02715蛋白互作的鉴定。构建了Filp诱饵载体pGBKFilp，证实了诱饵载体对酵母细胞无毒性作用，无自激活活性；构建了3个PilZ结构域蛋白PXO02715、PXO02374和PXO00049猎物载体，并转化酵母Y187菌株。采用酵母双杂交（Y2H）方法，发现了Filp可以与PXO02715发生互作，而不与PXO02374或PXO00049互作。原核表达和纯化了Filp蛋白（带有GST标签）和PXO02715蛋白（带有His6标签）。采用GST pull-down方法，证实了Filp与PXO02715蛋白之间的互作。 2. Filp与PXO02715蛋白结构域互作的鉴定。构建了Filp缺失不同结构域（REC，PAS，GGDEF和EAL）和Filp单独PilZ结构域的酵母诱饵表达载体，分析了两个蛋白不同结构域之间的互作模式，发现了缺失EAL结构域的Filp蛋白不能与PXO02715发生互作，而缺失REC、PAS和GGDEF不影响与PXO02715的互作；单独的EAL和GGDEF结构域可以与PXO02715发生互作。 3. PXO02374互作蛋白的筛选。构建了PXO02374诱饵载体，从Xoo cDNA文库中筛选了107个互作蛋白的阳性克隆，通过PCR和测序分析得到了14个候选基因。通过Y2H和GSTpull-down方法验证，获得了2个与PXO02374特异性互作蛋白（PXO03510和PXO05583）。 总之，本研究揭示了Filp与PXO02715互作关系，发现了EAL结构域是两者互作所必须的，Filp的GGDEF结构域也可与PXO02715发生互作。另外，鉴定了PilZ结构域蛋白PXO02374可以与PXO03510和PXO05583发生互作。因此， Filp和PXO02374受体的互作蛋白的鉴定，为深入地解析Xoo c-di-GMP信号途径及其毒性调控机理奠定了坚实的基础。