血管紧张素2型受体诱导膀胱癌细胞（EJ）凋亡的实验研究

作     者：万沛 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：谭万龙

授予年度：2013年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：膀胱癌 血管紧张素Ⅱ型受体 腺病毒 基因治疗 

摘      要：膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤的。它在中国有很高的发病率。传统的治疗方法包括手术、放疗和化疗,化疗的价值有一定的局限性,这是因为化疗会伤害正常细胞并导致复发率增高。近年来,随着分子生物学取得了突飞猛进的进展,基因治疗现如今已成为一种治疗膀胱癌的新的策略。 血管紧张素Ⅱ (Angiotensin Ⅱ, AngⅡ)是肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)中的一种生物活性肽,它通过与某些特定器官的AT1受体(AT1R)和AT2受体(AT2R)结合,调控心血管系统的稳态和组织的生长。AT2R在胚胎组织中高度表达,而在人体出生后其表达急剧降低。当心血管系统或者神经系统发生损伤时,AT2R会在修复组织损伤的过程中重新表达。有研究发现AT2R具有抑制细胞周期的功能,它可能在癌症中能够发挥抑制肿瘤生长的作用。提高AT2R在多种癌细胞系,例如前列腺癌、肺癌、嗜铬细胞瘤和结直肠癌等细胞系中的水平,能够诱导细胞凋亡,而且癌细胞的生长会受到抑制。 在我们的实验研究中,用表达AT2R的重组腺病毒载体将AT2R导入膀胱癌细胞中,以此来提高AT2R的表达水平,通过Q-PCR,流式细胞分选,凋亡染色等实验技术,检验AT2R的过度表达对膀胱癌细胞周期和凋亡的作用,并进一步探讨其可能的细胞内作用机制。 方法与材料 1.细胞培养 1.1、复苏 把冻存管从液氮中取出来,立即投入37℃水浴锅中,轻微摇动。液体都融化后,拿出来喷洒酒精后放到超净工作台里。把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中1000转离心5分钟。把上清液倒掉,加1ml培养基把细胞悬浮起来。吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动,使培养皿中的细胞均匀分布。 1.2传代 培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。把原有培养基吸掉,加适当的胰蛋白酶,消化1-2分钟,细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化,用移液枪吹打细胞,把细胞都悬浮起来。把细胞吸到15ml的离心管中,1000转离心5分钟。倒掉上清液,加1-2ml培养基,把细胞都吹起来。移入培养瓶继续培养。 2.重组腺病毒制备 我们采用以下两种重组腺病毒载体,一种是腺病毒载体包含被巨细胞病毒启动子控制的增强绿色荧光蛋白基因(Ad-CMV-EGFP),而另一种腺病毒载体包含AT2R基因和被巨细胞病毒启动子控制的增强绿色荧光蛋白基因(Ad-G-AT2R-EGFP)。 293T细胞接种于150mm2的组织培养皿中。感染复数(multiplicity of infection, MOI,virus/cell)为10的重组腺病毒载体被转到入293T细胞中。36至48小时后可观察细胞病变。通过冻融和两个氯化铯密度梯度的超速离心进行提纯,根据腺病毒DNA的OD260nm和OD280nm计算病毒颗粒和纯度,并通过空斑实验检测病毒滴度。 3.测量提取RNA的浓度 用含AT2R的腺病毒感染EJ细胞,48小时后,收集细胞,依据TRIZOL试剂盒说明书,提取RNA。之后,利用紫外分光光度计测定RNA的浓度及RNA在260nm和280nm的OD值。 4.检测AT2R的表达 我们从两个方面去观察,(1),腺病毒感染膀胱癌(EJ)细胞后,分别在24h、48h、72h通过荧光显微镜观察膀胱癌细胞,是否有绿色荧光蛋白的高效表达。(2),运用QPCR的技术,在腺病毒(含有Ad-G-AT2R-EGFP),对照组腺病毒(Ad-CMV-EGFP),感染膀胱癌细胞48小时后。按照TRIZOL使用说明书,提取膀胱癌细胞RNA,进行逆转录,转录成CDNA, AT2R引物为5 -CCACCCTTGCCACTACTAGCA-3 ;5 -CATTGTTGCCAGAGAT GTTCACA-3 .然后使用荧光定量PCR技术,其目的是为了检测细胞内AT2的表达水平。 ***2R基因对EJ细胞形态的影响 膀胱癌细胞(EJ细胞系,106/ml每孔)被接种于150mm2的组织培养皿中。第二天,Ad-CMV-EGFP或Ad-G-AT2R-EGFP被转导入膀胱癌细胞中。细胞培养液为添加10%FBS的DMEM。24小时、48小时和72小时后观察细胞形态。培养48小时后的细胞被用于凋亡试验。 ***2R基因对EJ细胞周期的影响。 膀胱癌细胞经过腺病毒感染后48小时,胰酶消化,悬浮细胞,经过PBS洗涤和离心后,用冰冻的70%乙醇固定至少18小时。然后放置于保持室温的暗室中,细胞在300μL的0.1%PI(50mg/L propridium iodide,0.1%sodium-citrate,0.1%tritonX-100)中