血管生成素及其受体在梅花鹿茸角中的表达与调节

作     者：张璐 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：岳占碰

授予年度：2012年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：血管生成素 梅花鹿 茸角 再生 

摘      要：本实验以梅花鹿为研究对象，利用原位杂交方法在核酸水平上研究了Ang-1、Ang-2及其受体Tie-2在梅花鹿茸角中的表达。结果表明，Ang-1mRNA在梅花鹿茸角的表皮层和真皮层均有表达，并且由外至内，表达量逐渐增强，在真皮层内的表达量较高，主要表达在真皮层的成纤维细胞上，在表皮层的基底细胞有少量表达，而在毛囊细胞和皮脂腺细胞内均未见其表达。Ang-1mRNA在鹿茸间充质层上表达量微弱，阳性细胞主要是未分化的间充质细胞。然而，Ang-1mRNA在前软骨层的表达量显著增强，主要表达于正在成熟的成软骨细胞上。Ang-1mRNA在梅花鹿茸角的过渡层主要表达于成软骨细胞和软骨细胞上。Ang-1mRNA在梅花鹿茸角软骨层表达较强，软骨层是由很多种细胞任意排列而组成的：在软骨层多细胞的软骨小梁区，Ang-1mRNA主要表达于成软骨细胞和破骨细胞上；在软骨层成熟的软骨小梁区，软骨小梁被大血管隔离形成明显的血管沟，Ang-1mRNA主要表达在血管周围的细胞和软骨细胞上；在开始矿化的软骨小梁区，Ang-1mRNA主要表达在血管周围的细胞和肥大软骨细胞上。Ang-2mRNA在梅花鹿茸角内的表达部位与Ang-1基本相似，但有微小差异。Ang-2mRNA主要表达于真皮层的成纤维细胞，前软骨层的正在成熟的成软骨细胞，及软骨层的成软骨细胞，破骨细胞，血管周围的细胞，软骨细胞，肥大软骨细胞。Ang-2mRNA在表皮层的基底细胞和过渡层的成软骨细胞和软骨细胞也有表达，但在间充质层内未见其表达。Ang-1和Ang-2的受体Tie-2mRNA在梅花鹿茸角内的表达与Ang-1和Ang-2有较大差异。结果显示，Tie-2mRNA只在鹿茸前软骨层和软骨层内有表达，主要表达于前软骨层的正在成熟的成软骨细胞，软骨小梁区的成软骨细胞和破骨细胞，以及血管周围的细胞和软骨细胞。分离提取梅花鹿茸角不同部位的蛋白，利用免疫蛋白印迹方法在蛋白水平上研究了Ang-1和Ang-2蛋白在梅花鹿茸角中的表达。结果显示，Ang-1和Ang-2蛋白在梅花鹿茸角真皮层、间充质层、前软骨层、过渡层及软骨层内均有表达，不同部位之间的表达量存在明显差异。在间充质层和前软骨层内，Ang-1蛋白的表达量很高，在真皮层和过渡层内，Ang-1蛋白的表达量较强，但是在软骨层内，Ang-1蛋白的表达量却非常少。Ang-2蛋白在真皮层和间充质层内表达量很高，在前软骨层、过渡层和软骨层内的表达量稍低。分离培养梅花鹿鹿茸软骨细胞，在软骨细胞贴壁后，向新鲜培养基中添加不同浓度的睾酮及雌二醇，研究睾酮及雌二醇对梅花鹿鹿茸软骨细胞增殖的影响。结果显示，体外培养的鹿茸软骨细胞在24h内可完全贴壁，倒置显微镜下观察可见，软骨细胞呈克隆样生长，细胞排列紧密，形态呈三角型或多边型，台盼兰染色结果显示细胞活性在90%以上。经浓度为10-7、10-8、10-9和10-10g/ml睾酮处理的软骨细胞的增殖活性明显高于对照组，经浓度为10-11g/ml睾酮处理的软骨细胞的增殖活性与对照组相比差异不显著。经浓度为10-9、10-10和10-11g/ml的雌二醇处理的软骨细胞增殖活性明显低于对照组，经浓度为10-7和10-8g/ml的雌二醇处理的软骨细胞增殖活性与对照组相比差异不显著。软骨细胞在浓度为10-9和10-10g/ml的睾酮处理后Ang-1的表达量增加；在浓度为10-8、10-9和10-10g/ml的睾酮处理后Ang-2的表达量增加。软骨细胞在浓度为10-7g/ml的雌二醇处理后Ang-1未见表达，在浓度为10-8g/ml的雌二醇处理后Ang-1的表达量减弱；在浓度为10-7、10-8和10-9g/ml的雌二醇处理后Ang-2的表达均受到抑制。这些研究结果将为进一步研究梅花鹿鹿茸生长及再生的分子调节机制提供重要理论依据。