中间丝蛋白Nestin在肾小管上皮细胞转分化中表达的研究

作     者：尤莉 

作者单位：复旦大学 

学位级别：博士

导师姓名：顾勇;陈靖;郝传明

授予年度：2008年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：肾间质纤维化 上皮细胞—肌成纤维细胞转分化 巢蛋白 E-钙粘蛋白 平滑肌肌动蛋白α 人近端小管上皮细胞 转化生长因子β1 巢蛋白 上皮细胞-肌成纤维细胞转分化 细胞迁移 巢蛋白 上皮细胞—肌成纤维细胞转分化 细胞迁移 RNA干扰 

摘      要：第一部分中间丝蛋白Nestin在间质纤维化动物模型肾小管上皮细胞转分化中表达的研究 背景 肾小管间质纤维化是一系列慢性肾脏疾病进展到终末期肾病的决定性因素之一,肾小管上皮细胞—肌成纤维细胞转分化（Epithelial-myofibroblast transition,EMT）在间质纤维化过程中发挥了重要的致病作用。巢蛋白（Nestin）属于第Ⅵ类中间丝蛋白,可能在各种细胞骨架蛋白中起桥梁作用,参与调节整个细胞骨架结构的稳定。我们先前的研究于国内外率先发现:在肾脏发育阶段,Nestin一过性表达于分化未成熟的小管上皮细胞,而在分化成熟的小管上皮细胞中再无表达。肾间质纤维化时,由于EMT过程涉及肾小管上皮细胞的去分化以及细胞形态和迁移能力的改变,因而肾小管发育阶段曾表达的Nestin有可能重新表达于肾小管上皮细胞并发挥一定的作用。因此,我们通过构建单侧输尿管梗阻（UUO）的肾间质纤维化动物模型,观察肾小管EMT过程中是否出现Nestin的表达。 方法 选用60只200-250g雄性SD大鼠,建立UUO动物模型,以假手术大鼠为对照,分别于手术后3天、6天、11天和14天处死大鼠。Masson染色观察大鼠间质纤维化情况,免疫组化法检测大鼠TGFβ1、上皮细胞表型特异性标志物E-钙粘蛋白、肌成纤维细胞表型标志物-平滑肌肌动蛋白α（αSMA）及Nestin在肾脏的表达;免疫荧光共染色检测Nestin和E-钙粘蛋白/αSMA表达的关系;实时定量PCR法检测大鼠皮质Nestin mRNA水平;Western blot法检测Nestin、E-钙粘蛋白和αSMA的蛋白水平;Pearson法分析Nestin改变与皮质间质容量分数及E-钙粘蛋白、αSMA蛋白表达的相关性。 结果 与对照大鼠比,随着输尿管梗阻时间的延长,大鼠肾间质纤维化面积逐渐增加,术后3天为2.1%,6天达到12.2%,11天时为18.0%,14天间质有近30%的面积出现纤维化,均有统计学意义（P0.05）。UUO大鼠的间质和小管内出现TGFβ1的表达。与此同时,随梗阻时间延长,UUO大鼠肾小管上皮表型E-钙粘蛋白表达下降,11天时下降明显,14天时表达量几乎无法检测到(UUO11d0.34±0.041,UUO14d0.02±0.007 vs CON 1.19±0.087,P0.05);肌成纤维细胞表型αSMA自术后3天即呈时间依赖性增加（与对照比P0.05）。大鼠小管EMT的同时,间质和小管部位先后出现Nestin的表达,荧光染色显示UUO6天时大鼠Nestin表达于E-钙粘蛋白缺失的小管上皮,并部分与αSMA共表达。随手术时间延长,Nestin mRNA和蛋白水平均呈时间依赖性增加。Nestin蛋白水平与间质纤维化程度（r=0.816,P0.05）及αSMA蛋白水平（r=0.97,P0.05）呈正相关,与E-钙粘蛋白水平呈负相关（r=-0.816,P0.05）。 结论 （1）在UUO间质纤维化动物模型中,存在着肾小管上皮细胞的转分化;（2）伴随着EMT的发生,分化未成熟小管上皮细胞标志物Nestin再次表达;（3）Nestin的表达与肾间质纤维化程度及细胞表型特异性标志物的改变密切相关。 第二部分Nestin在体外培养的人近端小管上皮细胞转分化中的研究 背景 肾小管上皮细胞是肾脏中生理功能最活跃的细胞之一,各种损伤因素,如缺血、缺氧、蛋白尿以及免疫炎症均可导致小管上皮细胞的损伤,损伤的小管上皮细胞发生活化,其细胞运动、迁移、吞噬等能力显著增强。而肾小管上皮细胞在组织发生过程中与间质成纤维细胞具有同源性,在一定的病理条件下可以发生上皮细胞—肌成纤维细胞转分化,直接参与肾间质纤维化损伤过程。Nestin作为中间丝蛋白的一种,在调控整个细胞骨架蛋白网络结构的稳定性中具有一定的作用,在肾脏发育早期,Nestin表达于分化未成熟的小管上皮细胞,参与其分化过程。我们前一部分的动物研究已经证实,分化未成熟小管上皮细胞标志物Nestin在肾间质纤维化小管EMT的过程中再次表达。因此,本部分研究将以体外培养的人近端小管上皮细胞（HKC）为观察对象,用TGFβ1诱导其转分化,体外验证小管EMT时,Nestin是否重新表达及其与肾小管上皮细胞去分化表型改变及细胞迁移能力的关系。 方法 体外人近端小管上皮细胞（HKC）培养,以5ng/ml转化生长因子β1（TGFβ1）干预不同时间,以非干预组为对照。实时定量PCR法检测Nestin mRNA水平,免疫荧光法及Western blot法检测Nestin、E-钙粘蛋白、αSMA的表达,Transwell迁移实验检测细胞迁移能力。 结果