抗CD40×HER2双特异性单链抗体的构建及抑制肿瘤增殖的实验研究

作     者：陆礼 

作者单位：天津医科大学 

学位级别：博士

导师姓名：刘彤

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：噬菌体展示 细胞表面分子40 人类表皮生长因子2 双特异性 单链抗体 

摘      要：目的采用基因重组及蛋白原核表达技术获取抗CD40×HER2双特异性单链抗体(CD40×HER2 Single chain Diabody,CD40×HER2 Sc Db),并检测其激活肿瘤特异性免疫及HER2分子靶向的功能。方法使用固相筛选法对抗CD40噬菌体展示免疫文库进行筛选,并通过噬菌体ELISA最终筛选获取高亲和力抗CD40 Sc Fv克隆。以此为模板,PCR扩增获取CD40 Sc Fv的重链可变区(heavy chain variable,VH)及轻链可变区(light chain variable,VL)序列,通过重叠PCR(Overlap Extension OE-PCR)将CD40 Sc Fv的VH及VL分两步与HER2 Sc Fv基因片段进行拼接获取CD40×HER2 Sc Db序列全长,DNA电泳及测序检测拼接序列的正确性。使用Nde I及Sal I进行CD40×HER2Sc Db序列及p ET28a原核表达载体的酶切并构建p ET28a-CD40×HER2 Sc Db原核表达载体。将构建的重组质粒转化Rosetta(DE3)感受态细胞,IPTG诱导蛋白表达,超声裂解诱导菌体,Ni-NTA琼脂糖纯化获取CD40×HER2 Sc Db,并对其进行理化性质的分析及分子结构预测。体外诱导培养小鼠骨髓源树突状细胞,流式细胞术检测CD40×HER2 Sc Db对树突状细胞表面CD80/CD86及MHC-II表达的影响。依据给予的干预不同,实验分为:生理盐水(Normal Saline,NS)对照组;单纯肿瘤抗原负载(Ag)组;Ag+CD40×HER2 Sc Db组以及Ag+TNF-α组4组。ELISA检测CD40×HER2 Sc Db对树突状细胞分泌IL-12的影响以及对T淋巴细胞分泌IFN-γ的影响。体外培养小鼠乳腺癌细胞系4T1,CCK8检测CD40×HER2 Sc Db诱导的肿瘤特异性T淋巴细胞对4T1增殖的抑制作用。构建4T1细胞系的BALB/c小鼠肿瘤模型,依据给予的不同干预,将模型小鼠随机分为:NS组;HER2 Sc Fv组;CD40×HER2 Sc Db1组(750μg/kg);CD40×HER2 Sc Db2组(1.5mg/kg)及CD40m Ab(5mg/kg)组。记录并描绘各组肿瘤生长曲线,ELISA检测肿瘤组织中IL-12、IFN-γ的表达水平。对肿瘤组织进行石蜡包埋切片,HE染色检测肿瘤组织淋巴细胞浸润,免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)检测肿瘤细胞Caspase-3的表达水平。体外培养小鼠成纤维瘤细胞系T6-17细胞系,细胞免疫荧光检测CD40×HER2 Sc Db对HER2的靶向功能,CCK8实验检测CD40×HER2 Sc Db对T6-17细胞的体外杀伤。依据给予的干预不同,实验分组为:NS组;CD40 Sc Fv组(2.5μg/m L);HER2 Sc Fv组(2.5μg/m L);CD40×HER2Sc Db1组(2.5μg/m L);CD40×HER2 Sc Db2组(5μg/m L);曲妥珠单抗组(15μg/m L)。 构建T6-17细胞的BALB/c-Nude小鼠肿瘤模型,依据给予的干预不同,将模型小鼠随机分为:NS组;CD40 Sc Fv组(150μg/kg);HER2 Sc Fv组(150μg/kg);CD40×HER2 Sc Db1组(150μg/kg);CD40×HER2 Sc Db2组(300μg/kg);曲妥珠单抗组(1mg/kg)。记录小鼠皮下肿瘤的体积的变化,对肿瘤组织进行石蜡包埋并切片,HE染色观察T6-17肿瘤组织细胞形态的变化。结果固相筛选法对噬菌体展示文库克隆的序列多样性发挥了收敛效果。第三轮筛选克隆的测序结果100%匹配的克隆占总克隆数的3.2%,并筛选获取了8个潜在阳性克隆,梯度噬菌体ELISA检测各潜在克隆的亲和力表明,8#克隆与CD40的亲和力最佳,其与BSA亲和力的比值3,符合阳性克隆筛选的标准。PCR扩增CD40 Sc Fv的VH及VL片段,DNA电泳及测序结果表明CD40 Sc Fv的VH及VL碱基长度分别为345bp及324bp,与预期大小相符,重叠PCR拼接获取的CD40×HER2 Sc Db基因序列长度为1464bp,与预期相符。使用0.5mmol/L IPTG可获得最佳蛋白诱导效果,蛋白变性电泳结果可于55Kd左右见一明显条带,其大小与预期相符,对His-tag进行Western Blot检测同样可于55Kd左右见一明显条带,BCA检测纯化后蛋白浓度为2.7mg/ml。流式细胞术检测Ag+CD40×HER2Sc Db组DC表面CD80、CD86及MHC-II的表达率分别为93.5±3.1%86.00±