IHNV N和G基因在杆状病毒表达系统中的表达及抗体制备

作     者：谢三磊 

作者单位：甘肃农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王雯慧;孙惠玲

授予年度：2014年

学科分类：0906[农学-兽医学] 09[农学] 

主      题：传染性造血器官坏死病病毒 杆状病毒表达系统 N基因 G基因 

摘      要：本研究以某渔场病鱼组织内分离得到的传染性造血器官坏死病病毒（IHNV）BJLL株为材料，进行了该病毒的实验室培养、鉴定及其某些生物学特性研究，在此基础上，制备了鼠抗IHNV多克隆抗体，克隆表达了IHNV的核蛋白(N)和糖蛋白(G)，并对两种蛋白进行Western-Blot和IFA检测，以表达出的IHNV N蛋白作为免疫原，免疫小鼠制备抗血清，并对其进行效价测定等应用。结果如下： 1、IHNV病毒的增殖纯化和多抗制备 利用对IHNV敏感的大鳞大麻哈鱼胚胎细胞系(CHSE)增殖病毒；测定了培养液中的病毒滴度和病毒在CHSE细胞中的生长曲线；采用超速离心法对收获的病毒进行了纯化；利用纯化的IHNV病毒免疫小鼠制备多克隆抗体，间接ELISA法检测表明获得的鼠抗IHNV血清效价为1:8000。 2、IHNV N蛋白的表达纯化及抗原性分析 参照GenBank已发表的IHNV的WRAC株N基因序列，以分离得到的IHNV毒株（BJLL株）为实验材料，提取RNA，反转录为cDNA，将N基因克隆到pGM-T载体上，对重组质粒进行PCR鉴定和序列测定。结果表明，扩增N基因片段的长度为1176bp，所测得的基因序列与GenBank上所报道的IHNV的核蛋白序列同源性在99％以上。利用杆状病毒表达系统表达N基因，成功构建了重组质粒pFB-LIC-Bse-N，制备了reBacmid-N，并进行PCR鉴定；reBacmid-N转染Sf9昆虫细胞，27℃培养72h～96h，收集细胞。表达产物进行SDS-PAGE电泳分析，结果与预期蛋白大小一致，Western-blot和IFA检测表明，该表达蛋白具有良好的免疫学活性。用纯化的N蛋白免疫Balb／c小鼠，制备高免血清。以纯化病毒包被ELISA板检测N蛋白血清滴度，测得鼠抗N蛋白血清滴度为1:8000。 3、IHNV G基因的表达及鉴定 参照GenBank已发表的IHNV WRAC株G基因序列，以分离得到的IHNV毒株（BJLL株）为实验材料，提取RNA，反转录为cDNA，将去掉末端40个疏水性氨基酸的G基因克隆到pGM-T载体上，对重组质粒进行PCR鉴定和序列测定。结果表明，扩增G基因片段的长度为1380bp。利用杆状病毒表达系统对G基因进行表达，成功构建了重组质粒pFB-LIC-Bse-G，制备reBacmid-G，并进行PCR鉴定；reBacmid-G转染Sf9昆虫细胞，27℃培养72h～96h，收集细胞。表达产物进行SDS-PAGE电泳分析，结果与预期蛋白大小一致，Western-blot和IFA检测表明，该表达蛋白具有良好的反应原性。