羊口疮病毒感染宿主细胞的蛋白质组变化及功能分析

作     者：孔汉金 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吴斌

授予年度：2014年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：羊口疮病毒 单克隆抗体 增殖动力学 亚细胞定位 蛋白组学 

摘      要：羊传染性脓疱(contagious ecthyma)俗称“羊口疮,是由痘病毒科,副痘病毒属羊口疮病毒(orf virus, ORFV)引起的一种急性、高度接触性人兽共患传染病。该病主要侵害绵羊和山羊。临床上患病动物以口唇周围和乳房部位皮肤形成丘疹、水疱、脓疱和疣状痂皮为特征。该病发病率高,病死率低。羊传染性脓疱的暴发和流行不但严重危害肉羊产业的健康发展,而且威胁人们的身体健康。 随着基因组测序技术的发展,多株羊口疮病毒的全基因组序列被测定,这为羊口疮病毒致病的分子机制研究提供了参考,但是基因组学技术研究只针对病原体自身,而不能反映病原体与宿主间的相互作用。目前利用蛋白质组学技术对ORFV和宿主细胞相互作用的研究未见相关报道。本研究以ORFV和山羊皮肤成纤维细胞(goat skin fibroblasts, GSFs)为研究对象,应用同位素标记相对和绝对定量联合二维液相色谱串联质谱技术(two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry coupled with isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ-2D-LC-MS/MS)对ORFV感染GSFs后的蛋白组学变化,进行了探索研究和功能分析,期望能为人们了解羊口疮病毒与宿主细胞的相互作用研究提供参考信息,具体研究内容如下： 1.羊口疮病毒囊膜蛋白(B2L)单克隆抗体(Monoclonal Antibodies, McAb)的制备 参照GenBank上公布的ORFV B2L基因序列(GU320351)设计引物,应用PCR方法获得ORFV B2L基因全长,并将其定向连接到原核表达载体pET-30a上,在此基础上进行蛋白表达和纯化。以纯化后的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,并利用杂交瘤技术将免疫脾细胞和SP2/0细胞进行细胞融合,经过4次筛选和克隆,获得4株稳定分泌抗ORFV B2L蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株,命名为D1-B3, E4-C6,3-A11-2,B1-F3-A3。单抗亚类鉴定结果表明4株单抗的亚类均为IgG1, Western-blot和间接免疫荧光试验结果表明4株单抗均能与羊口疮病毒发生特异性反应。 2.羊口疮病毒在GSFs上的适应性和增殖特性研究 将从患病羊痂皮病料中分离出的ORFV在GSFs上进行适应性培养,以探讨病毒在该细胞上的增殖特性。对GSFs首次接种ORFV后进行细胞病变观察和间接免疫荧光检测(indirect immunofluorescent assay, IFA)。结果显示ORFV首次感染GSFs24h后开始有少量细胞出现肿胀和变圆,60h细胞开始脱落,72h病变完全。IFA结果显示接种ORFV的GSFs有特异性绿色荧光,表明ORFV能在GSFs内复制增殖。收集ORFV首次感染GSFs后不同时间点的病毒液进行病毒基因组拷贝数的Real-time PCR检测和TCID50测定,Real-time PCR检测结果显示感染后9h即可检测到病毒DNA,随感染时间延长病毒基因组拷贝数快速上升,72h达到最大(5.52×106copy/uL)。TCID50测定结果与病毒基因组拷贝数的增长趋势基本一致。 在此基础上,将ORFV在GSFs上连续传至15代使其适应该细胞。结果显示随着传代次数的增多,细胞开始出现病变时间逐渐缩短,至10代后病变稳定。以第15代GSFs适应毒(CHINA Luoyang2013)感染GSFs,感染后不同时间分别收集感染细胞和培养上清,利用Real-time PCR对不同样品的病毒DNA进行定量分析,绘制ORFV在GSFs上的一步法生长曲线。结果显示：感染后3h-35h,细胞内病毒DNA含量随感染时间延长而增加,之后因细胞裂解病毒DNA含量逐渐降低；细胞外病毒DNA含量呈“S型曲线增长,感染后0h-11h为潜伏期,病毒含量维持在较低水平,第11h-43h为突破期,病毒DNA含量迅速增加,感染后43h-51h增长速度减慢,逐步进入稳定期。 3.羊口疮病毒的遗传进化分析和ORF125蛋白的亚细胞定位 利用DNA star和MEGA4.0对ORFV GSFs适应毒株CHINA Luoyang2013进行基于B2L基因的遗传进化分析,结果表明CHINA Luoyang2013与2012中国疫苗株(JQ904789)同源性最高,处于同一进化分支。 利用DNA star和在线ExPASy工具对ORFV ORF125蛋白与Bcl-2蛋白家族成员的氨基酸序列和二级结构进行比较分析,结果发现ORF125与Bcl-2家族蛋白一级结构同源性很低,但两者二