组蛋白甲基化转移酶SETDB1对食道癌增殖及凋亡的影响

作     者：石敏 

作者单位：西南医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙兴旺

授予年度：2018年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：SETDB1 H3K9 食道癌 增殖 凋亡 组蛋白甲基化转移酶 

摘      要：目的食道癌是死亡率较高和预后较差的恶性消化道肿瘤之一,预计未来10年将成为日益严重的健康问题。近年来,随着医学的发展,虽然对食道癌的诊断和治疗取得了一些进展,但食道癌的病死率仍然居高不下,主要原因是食道癌早期症状多不典型,时轻时重,持续时间长短不一,甚至可无任何症状,易被忽略。因此,需要进一步研究食道癌发生发展的分子机制,找到有效的分子生物学靶标对食道癌进行诊断,以达到精确判断早期食道癌的目的,以及对食道癌侵袭、转移、复发等作出有效判断,从而提高食道癌患者诊疗效率,减缓死亡率,改善患者的生活质量。SETDB1基因编码组蛋白甲基化转移酶,映射到人类染色体1q21上,在哺乳动物的组织细胞中广泛表达。研究发现,SETDB1与肿瘤细胞的增殖、凋亡等多种生物学行为以及患者的预后密切相关,已被确立为人类肺癌、黑色素瘤和肾肿瘤的致癌基因。因此,SETDB1被认为是一种具有潜在应用价值的肿瘤标记物及预后评价的生物学指标。组蛋白甲基化转移酶主要参与组蛋白甲基化的过程,对肿瘤的生长演变起着重要作用,因此对组蛋白甲基化转移酶的功能和作用机制的研究,有着十分重要的意义。目前的已有研究结果表明,SETDB1对小鼠的胚胎发育发挥重要作用,对神经系统的作用尤为明显。组蛋白甲基化转移酶SETDB1主要参与H3K9me3的甲基化,对肿瘤的增殖、凋亡也具有极其重要的作用。但是,SETDB1在食道癌中是否表达以及对食道癌增殖及凋亡是否有影响尚不清楚。在此,我们初步探索了SETDB1对食道癌增殖和凋亡的相关作用。本课题首先采用免疫组化技术检测SETDB1在食道癌患者组织中的表达情况,同时对相关临床病理指标和其表达量是否存在的相关关系作出分析,然后采用siRNA干扰技术沉默食道癌细胞中SETDB1基因,使其低表达,分析判断组蛋白甲基化转移酶SETDB1低表达对食道癌细胞增殖凋亡的影响。方法1、采用免疫组织化学技术检测SETDB1在食道癌组织中的表达,分析其表达量与相关临床指标相关性检测44例食道癌组织及36例癌旁未受肿瘤侵袭的黏膜组织中SETDB1的表达情况,随后对食道癌组织SETDB1蛋白的表达与癌旁未受肿瘤侵袭的黏膜组织SETDB1蛋白的表达是否存在临床病理特征相关性作出分析。2、沉默SETDB1后检测食道癌细胞增殖及凋亡的能力1)采用qRT-PCR技术检测两种食道癌细胞株KYSE150、EC9706中SETDB1的表达,筛选出SETDB1 mRNA表达相对较高的细胞株,并且对其干扰沉默SETDB1基因,进一步后续相关研究。2)筛选出SETDB1基因表达量相对较高的食道癌细胞株EC9706,使用siRNA干扰技术对SETDB1基因进行沉默,沉默食道癌细胞株SETDB1基因后,再运用qRT-PCR技术和Western Blot技术检测细胞中mRNA及蛋白的表达情况,测定其转染效率。3)检测沉默SETDB1基因前后对食道癌细胞凋亡和增殖能力的影响采用流式细胞技术和CCK8法;同时沉默食道癌细胞SETDB1基因后,检测促进增殖基因CyclinD1和抑制凋亡基因Bcl-2、促进凋亡基因Bax的mRNA表达水平和蛋白的表达情况,检测方法采用qRT-PCR技术和Western Blot技术。结果1、SETDB1在食道癌组织中的表达和临床意义采用免疫组织化学技术检测44例食道癌组织及36例癌旁组织SETDB1表达情况,结果显示,SETDB1在食道癌组织中的表达高于癌旁黏膜未受肿瘤侵袭组织,差异具有统计学意义(P0.05)。1、沉默SETDB1后对食道癌细胞增殖及凋亡能力的影响1)组蛋白甲基转移酶SETDB1在食道癌细胞KYSE150和EC9706中均有表达,且在食道癌细胞株EC9706中表达量相对较高。2)组蛋白甲基转移酶SETDB1/siRNA两条合成片段,SETDB1/siRNA-2/-3两条干扰效率相当,且均低于对照组SETDB1/NC3)CCK8实验结果显示:沉默SETDB1基因后,食道癌细胞EC9706/SETDB1/siRNA-2/-3与对照组EC9706/NC相比,其增殖能力降低。4)运用qRT-PCR、Western blot技术检测结果显示:抑制凋亡基因Bcl-2和促进增殖基因CyclinD1的mRNA及蛋白表达水平降低,促进凋亡基因Bax的mRNA及蛋白表达水平升高。结论SETDB1在食道癌组织中高表达,SETDB1的高表达与肿瘤淋巴结转移具有相关性,部分肿瘤淋巴结未转移者呈现低表达。体外实验证明,食道癌细胞株的增殖及凋亡能力受到组蛋白甲基转移酶SETDB1基因