利用肝癌外泌体发现lnc85标志物及传递Cu-Cy纳米光敏剂的研究

作     者：黄雪静 

作者单位：广西医科大学 

学位级别：博士

导师姓名：何敏

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：肝细胞癌 血浆外泌体 长链非编码RNA RP11-85G21.1 miR-324-5p 肝细胞癌 光动力学治疗 铜胺纳米材料 光敏剂 

摘      要：肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球范围内的恶性肿瘤之一。在中国具有相对较高的发病率和病死率,2015年HCC新发病例和死亡病例数分别为466,100和422,100例。临床上,由于缺乏特异性的生物标志物和明显的临床症状,大多数HCC患者在被确诊时已处于肝癌晚期,超过80%的患者出现预后不良。另外由于肝癌的复发和转移,目前应用于临床的治疗方法都存在一定的局限性,且治疗效果难以尽如人意。因此,研究与HCC发病和发展有关的分子机制从而发现新的治疗靶点,同时研发新的有效的治疗手段迫在眉睫。外泌体是由多种类型细胞分泌,粒径在30～150 nm之间的囊泡样小体。它包含有供体母细胞的多种蛋白质和核酸物质(包括DNA和RNA),通过作为细胞间通讯的介质参与多种生物学过程,如细胞增殖、迁移和凋亡活动等。其内含物与机体的病理及生理状态密切相关。有研究表明,外泌体在疾病,尤其是在癌症的起源和发展中起着重要作用,是癌症恶性进展的重要参与者。因此分析循环外泌体中的内含物、揭示HCC发生发展的分子机制,有助于发现新的治疗靶点、开发疾病的生物标志物。近年来,循环外泌体中的长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)越来越受到关注。lncRNA为一种不具备蛋白编码功能的RNA,可以参与细胞迁移,增殖和凋亡过程的调控,在人类疾病中发挥着关键性的作用,尤其是在癌症形成和发展的过程中。近10年来,随着研究的不断深入,许多学者揭示了lncRNA在HCC的发生、发展和转移中的作用,使其被广泛关注并逐渐发展成为一个高度活跃的研究热点。但仅有少数lncRNA的分子功能得到充分的挖掘,绝大部分的lncRNA的功能未得到鉴定和注释。此外,由于外泌体与其供体细胞间的特异性亲和性,及其天然的生物相容性,是治疗性药物递送的理想载体。目前,已有研究者成功运用外泌体作为癌症化疗药物的载体进行肿瘤的靶向治疗。除运载传统化学药物外,外泌体还可作为一些新型药物的载体。铜胺纳米材料(Copper-cysteamine,Cu-Cy NPs)是一种新型的光敏剂,它在紫外光、X射线及微波的激发下可以产生红光,是实现光动力疗法(Photodynamic therapy,PDT)的主要因素之一。PDT由于低毒、低创、易操作及良好的重现性,成为传统手术和化疗理想的替代方式。PDT主要通过由光激活的光敏剂与组织细胞中存在的氧分子发生反应,产生细胞毒性的活性氧继而引发目标细胞的凋亡而达到治疗目的。目前Cu-Cy NPs的PDT应用仍然处于研究的早期阶段,其生物毒性、光动力反应性以及生物递送途径还未得到充分的评估。本研究包括两部分内容:第一部分,利用肝癌外泌体发现lnc85标志物及相关作用机制研究;第二部分,Cu-Cy新型纳米光敏剂的抗肝癌及外泌体传递效应的研究。在第一部分,主要对HCC循环外泌体中lncRNA的表达特征进行描述,探索其参与HCC发生、发展的分子机制,并评估其作为HCC血清生物标志物的潜在价值;第二部分,通过体内试验和体外试验探讨Cu-Cy NPs在HCC的光动力学治疗中应用的可能性,并探索外泌体作为Cu-Cy NPs运送载体的可能。第一部分:利用肝癌外泌体发现lnc85标志物及相关作用机制研究目的:探索循环外泌体中的lncRNA的表达特征,探索lncRNA参与HCC发生发展的分子机制,并评估其作为HCC血清生物标志物的潜在价值。方法:1.外泌体抽提试剂盒提取4例肝细胞癌患者和6例健康对照者血浆中的外泌体,并通过RNA全转录本测序检测两组血浆外泌体中差异表达的lncRNA和mRNA。2.与包含有34种细胞基因转录本信息的开放数据库进行对比,综合描述HCC患者血浆外泌体中lncRNA和mRNA的相对表达特征。3.超高速离心法提取HepG2和Huh7细胞培养上清中的外泌体并采用Nanosight、TEM和Western blot进行验证.。4.选取血浆外泌体中差异表达量显著升高的lncRNA进行细胞和细胞外泌体的qRT-PCR验证,确定候选差异表达lncRNA。5.针对候选lncRNA设计siRNA,通过siRNA转染HL-7702,HepG2和Huh7细胞,采用CCK-8试剂盒、Transwell试验和流式细胞术检测候选lncRNA对细胞增殖、迁移、以及凋亡的影响,选择对肝癌细胞行为学影响明显的RP11-85G21.1(lnc85)做进一步研究。6.通过Ensembl、LNCipedia version和lncLocator数据库查询lnc85的基因组定位、具体序列信息、序列长度、亚细胞定位等基本信息;并通过靶基因预测网站RegRNA预测lnc85的靶向microRNA。***-PCR检测lnc85抑制前后HL-7702,He