传染性造血器官坏死病病毒-SX1704毒株的序列分析及GiCK细胞系的建立

作     者：刘思佳 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈红英

授予年度：2019年

学科分类：0906[农学-兽医学] 09[农学] 

主      题：传染性造血器官坏死病病毒 糖蛋白 真核表达 序列比对 同源性 进化树 异育银鲫肾细胞系 

摘      要：传染性造血器官坏死病病毒(Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)是一种单股负链RNA病毒,可以水平、垂直感染虹鳟、硬头鳟等冷水鱼类,引起的高致病性和高死亡率给我国鲑鳟养殖业带来了巨大经济损失。IHNV隶属于弹状病毒科(Rhabdoviruses)粒弹状病毒属(Novirhabdovirus)。自1985年中国辽宁省发现第一例IHNV病毒以来,有关IHNV的疫情在中国北京、河北、山东、甘肃、四川、吉林、新疆等地相继报道。多地IHNV病毒感染的检出表明该病毒已成为危害优良鲑鳟种苗的重大隐患。通过对IHNV中国株进行鉴定、分析,进一步明确国内IHNV的分布和遗传进化特征,对于IHNV的安全防治和风险管控具有深远的意义。本实验从中国陕西省宁陕县某渔场采集患病虹鳟,鉴定病样为IHNV阳性。通过在GenBank中查找IHNV序列并设计扩增引物,采用RT-PCR的方法扩增获得部分基因片段。将扩增得到的序列克隆到载体pTriEx-1.1或T载体上构建重组质粒,并进行测序分析。采用步进法扩增,成功克隆到IHNV的六个基因:N、P、M、G、NV、L,以及基因之间的非编码区。将虹鳟病鱼中鉴定的IHNV毒株命名为SX1704,并将序列提交至GenBank获得登录号:MH629974。IHNV-SX1704毒株全长10802bp,从3’到5’依次编码:核衣壳蛋白-聚合酶相关磷酸蛋白-基质蛋白-表面糖蛋白-非结构蛋白-病毒聚合酶蛋白。将毒株SX1704与GenBank其他IHNV序列进行同源性比对,发现与IHNV中国株CH20101008(登录号:KJ421216),HLJ-09(登录号:JX649101)有很高的核酸同源性,相似性百分比达99.3%。CH20101008作为参考毒株,IHNV-SX1704与其相比有78个核苷酸突变,其中24个导致编码氨基酸突变。对SX1704的全序列和六个基因分别构建生物进化树。系统发育进化结果显示,除中国株外,IHNV-SX1704毒株与韩国株、日本株有较近的亲缘关系,基于G基因分型表明SX1704属于J基因型的J Nagano亚型。IHNV的G蛋白是病毒的囊膜蛋白,是病毒用于识别宿主的结构蛋白,也是疫苗设计的主要靶标。本论文的研究中,将IHNV-G基因克隆到膜蛋白表达载体pQBD上,获得了重组质粒pQBD-G。将重组质粒与线性化的杆粒qBac-III共转染sf9细胞培养得到重组杆状病毒rAcMNPV-G。Western blot检测表明G蛋白在重组杆状病毒中成功表达,为今后重组病毒疫苗的免疫效果检测打下了基础。本实验还建立了一株异育银鲫肾细胞系并命名为GiCK。通过用线粒体16s核糖体RNA鉴定新制备细胞系的种属来源,证实其来自于异育银鲫。经PCR检测证明CyHV-2在GiCK细胞上连续传代不超过三代。将构建的重组病毒rAcMNPV-GFP转导GiCK细胞证实重组病毒能进入异育银鲫细胞。因此,GiCK细胞能否作为CyHV-2体外连续增殖的高敏感性细胞系仍值得讨论。细胞系的建立对将来关于CyHV-2病毒感染及其引起疱疹病毒性造血器官坏死病的发病机制的深入研究可能发挥重要作用。