Parkin的亚硝基化修饰对DMT1的调控及其在帕金森病中的作用

作     者：钟燕敏 

作者单位：青岛大学 

学位级别：硕士

导师姓名：姜宏

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：帕金森病 亚硝基化 二价金属离子转运体1 Parkin MPTP 

摘      要：帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是一种常见的神经系统退行性疾病,主要病理改变是中脑黑质多巴胺能神经元的丢失,残存神经元内α-突触核蛋白（α-synuclein,α-Syn）聚集形成路易小体,同时伴有铁在黑质的特异性聚积。硝化应激可引发多种蛋白质,如parkin蛋白等,发生亚硝基化（S-nitrosylation,SNO）,参与神经退行性疾病的发生及进展。Parkin是一种E3泛素连接酶,介导了铁转运蛋白二价金属离子转运体1（divalent metal transporter 1,DMT1）的泛素化降解。本课题组在前期研究中发现DMT1蛋白水平的高表达是黑质铁聚集的重要原因之一,但对其调控机制尚不清楚。由于硝化应激是PD中较为常见的病理表现,因此,深入探讨parkin蛋白的亚硝基化修饰对DMT1的调控及其机制,对阐明PD中黑质铁聚集的原因具有重要意义。本研究首先在SH-SY5Y细胞上,观察了给予一氧化氮（nitric oxide,NO）供体亚硝基谷胱甘肽（nitrosoglutathione,GSNO）处理后,细胞NO水平、SNO-parkin和DMT1蛋白表达的变化,同时检测了细胞铁摄取功能的改变。给予1-甲基-4-苯基吡啶（1-methyl-4-phenylpyridinium,MPP+）处理,观察上述指标的变化。然后在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP）制备的PD动物模型上,观察黑质SNO-parkin和DMT1蛋白水平的变化。为了进一步阐明parkin的亚硝基化修饰对DMT1调控的分子机制,在SH-SY5Y细胞上,我们观察了parkin蛋白发生亚硝基化修饰对DMT1泛素化水平的影响;以及p53依赖途径中,SNO-parkin对DMT1的调节机制。本研究为阐明PD发生过程中,黑质区DMT1表达增高的原因提供一定的实验依据。实验结果如下:1.在SH-SY5Y细胞上,转染parkin 24 hrs后,DMT1的蛋白水平降低了53.9%,与对照组相比,差别有高度统计学意义（P0.05）。8.在HEK293T细胞上,共转染Flag-WT-parkin、HA-Ub和Myc-DMT1 24 hrs后,DMT1的泛素化水平明显升高,而经GSNO预处理后,DMT1的泛素化水平明显降低。Flag-C241A-