江浙蝮蛇毒L-氨基酸氧化酶的结构和功能研究信号传导相关蛋白SIRP，CRK及囊泡融合蛋白Syntaxin3的表达、纯化及晶体生长

作     者：张宏民 

作者单位：中国科学技术大学 

学位级别：博士

导师姓名：牛立文;滕脉坤

授予年度：2004年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 

主      题：L-氨基酸氧化酶 江浙蝮蛇毒 基因序列 信号传导相关蛋白 囊泡融合蛋白 催化活性 

摘      要：通过柱层析的方法从江浙蝮蛇毒中纯化到了一种新的L-氨基酸氧化酶***-LAAO由两个相同的亚基通过一个二次旋转轴结合在一起。每个单体由486个氨基酸残基组成，分子量为60.7KDa。 AHP-LAAO立体专一性地催化L-氨基酸的氧化脱氨，产生α-酮酸，氨和过氧化氢。AHP-LAAO的最适反应pH为8.5。对于疏水氨基酸，如L-苯丙氨酸，L-亮氨酸，L-色氨酸等的催化活性较强，对于极性和带电荷氨基酸则不具有催化活性。在室温及pH8.5条件下，AHP-LAAO对L-亮氨酸的Km和Kcat值分别为0.25mM和31.1s-1。 AHP-LAAO具有多种生物学活性。AHP-LAAO具有诱导培养的HeLa细胞凋亡的活性，在较低的浓度下(0.5μg/ml) AHP-LAAO就能够诱导HeLa细胞凋亡。AHP-LAAO具有抑制ADP诱导的血小板聚集的活性。实验表明，酶催化产生的过氧化氢在此过程中发挥决定性作用。AHP-LAAO能够诱导组织水肿。以小鼠脚板为研究对象，AHP-LAAO的最小水肿剂量为5.0μg。AHP-LAAO还具有抗菌活性，能够抑制革兰氏阴性菌大肠杆菌，革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌和枯草杆菌的生长。实验表明，AHP-LAAO的抗菌活性是由酶催化产生的过氧化氢引起的。但是，反应中产生的过氧化氢比较少，不足以抑菌。进一步的研究表明，AHP-LAAO能够结合到细菌表面。这种结合加强了反应中产生的过氧化氢的抑菌作用。对猪肾D-氨基酸氧化酶抗菌活性的研究，表明D-氨基酸氧化酶也具有抗菌活性，纠正了前人的观点。 通过RT-PCR的方法获得了AHP-LAAO的基因序列。序列比较的结果表明，AHP-LAAO与其它蛇毒来源的LAAOs具有较高的同源性。 通过气相扩散悬滴法获得了AHP-LAAO与柠檬酸，L-Phe，L-Leu，L-Ala及自杀性底物L-vinylglycine的复合物晶体。应用分子置换法解出了相应复合物的结构。结构分析表明，AHP-LAAO由三个不同的结构域组成，分别是底物结合结构域，FAD结合结构域和螺旋结构域。AHP-LAAO的每一个单体含有一个FAD辅基和两条糖链。底物结合到酶的催化活性中心，侧链与残基Phe227的苯环形成疏水作用，羧基部分与Arg90的侧链形成氢键相互作用。底物的α碳位于FAD异咯嗪环N5原子的上方，便于电子传递。N5原子正前方保守的水分子可能参与了反应中间物的水解。AHP-LAAO可能采用与DAAO相似的催化机制完成对L-氨基酸的氧化（氢转移机制或者“电子—质子—电子机制）。复合物晶体结构的解析，为进一步研究活性中心各残基在催化过程中的作用及相应的催化机制奠定了坚实的基础。