姜黄素干预TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞表达FKN的实验研究

作     者：朱佃香 

作者单位：浙江中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：覃宇果

授予年度：2010年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：动脉粥样硬化 姜黄素干预 脐静脉 内皮细胞表达 趋化因子 血管保护 

摘      要：目的：研究肿瘤坏死因子-α（TNF-α）对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）表达不规则趋化因子（FKN）的影响，以及姜黄素对其干预作用，以期进一步了解FKN在动脉粥样硬化（AS）形成中的炎症机制、信号转导机制和研究姜黄素在保护血管内皮细胞机制中的抗炎作用。 方法： 1.体外培养HUVEC。 ***法检测姜黄素的半数抑制浓度(IC50值)。通过MTT法，从0μmol/L、0.1μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L八个浓度中筛选出HUVEC对姜黄素的最大耐受药物浓度。 3.实时荧光定量PCR检测不同TNF-α药物浓度和作用时间刺激HUVEC引起FKN的基因表达水平。分别检测空白对照、TNF-α0.1ng/ml、TNF-α0.5ng/ml、TNF-α1.0ng/ml对HUVEC的FKNmRNA上调程度，实时荧光定量PCR检测培养16小时（h）后上述FKNmRNA表达水平，依据结果选择TNF-α0.5ng/ml进行后续研究。用TNF-α0.5ng/ml的药物浓度作用于HUVEC，分别比较药物作用2h、4h、8h、12h、16h、24h后以及空白对照组相互之间FKNmRNA的不同表达程度。 ***-Blot和实时荧光定量PCR检测不同的姜黄素药物浓度干预FKN基因和蛋白的表达效果。比较空白对照组、TNF-α0.5ng/ml+姜黄素0μmol/L组、TNF-α0.5ng/ml+姜黄素2μmol/L组、TNF-α0.5ng/ml+姜黄素5μmol/L组、TNF-α0.5ng/ml+姜黄素10μmol/L组共5组刺激HUVEC，作用16h后使用荧光定量PCR法对HUVEC的FKNmRNA的不同表达程度进行检测;比较空白对照组、TNF-α0.5ng/ml+姜黄素0μmol/L组、TNF-α0.5ng/ml+姜黄素2μmol/L组、TNF-α0.5ng/ml+姜黄素5μmol/L组共4组刺激HUVEC，作用16h后，使用Western-blot法比较各组间FKN的蛋白表达水平。 结果： 1.实验过程中HUVEC生长状态良好，呈现典型的铺路石状排列，生物学性状稳定。 ***法筛选出药物姜黄素对HUVEC的抑制率约为5％时的药物浓度为2～5μmol/L，是最佳药物浓度。 ***-α0.5ng/ml和1.0ng/ml均比Blank组能明显地提高FKN的mRNA表达量的变化倍数;TNF-α0.5ng/ml比TNF-α0.1ng/ml组能明显地提高FKN的mRNA表达量的变化倍数。不同时间段（2h、4h、8h、12h、16h、24h）TNF-α0.5ng/ml刺激HUVEC，与Blank组比较，16h时FKN的mRNA表达量变化倍数显著增加。 4. TNF-α0.5ng/ml+姜黄素0μmol/L组作用细胞16h后， FKNmRNA表达量变化倍数比Blank组明显增多;与TNF-α0.5ng/ml+姜黄素0μmol/L组比较，TNF-α0.5ng m/L+姜黄素2μmol/L组、TNF-α0.5ng/mL+姜黄素5μmol/L组、TNF-α0.5ng/mL+姜黄素10μmol/L组刺激HUVEC后其FKNmRNA表达量变化倍数均明显下降;TNF-α0.5ng/mL+姜黄素2μmol/L组、TNF-α0.5ng/mL+姜黄素5μmol/L组、TNF-α0.5ng/mL+姜黄素10μmol/L组，刺激HUVEC后其FKNmRNA表达量变化倍数无显著性差异。Blank组、0.5ng/mL TNF-α+0μmol/L姜黄素组、0.5ng/mLTNF-α+2μmol/L姜黄素组、0.5ng/mL TNF-α+5μmol/L姜黄素组刺激HUVEC16h后，Western-Blot检测FKN蛋白表达的变化：0.5ng/mL TNF-α+0μmol/L姜黄素组显影最深，而Blank组、0.5ng/mL TNF-α+2μmol/L姜黄素组、0.5ng/mL TNF-α+5μmol/L姜黄素组均显色较淡。 结论：0.5ng/ml的TNF-α作用于HUVEC16小时能显著提高HUVEC的FKNmRNA的表达，2～5μmol/L的姜黄素药物浓度是下调TNF-α诱导HUVEC表达的FKNmRNA及蛋白的最有效的药物浓度，16小时是姜黄素的最佳作用时间。本研究说明一定浓度的姜黄素可以通过抗炎机制有效地保护血管内皮细胞，在减缓动脉粥样硬化的发生发展过程中发挥重要的作用。