拟南芥种子特异性表达载体的构建及其在种子休眠研究中的应用

作     者：陈凤莹 

作者单位：中国科学院研究生院 

学位级别：硕士

导师姓名：刘永秀

授予年度：2012年

学科分类：09[农学] 0903[农学-农业资源与环境] 

主      题：特异性表达载体 种子休眠 拟南芥 候选基因 

摘      要：调控种子休眠的基因往往都具有多种功能，当研究这些基因与休眠的关系时，由35S启动子驱动的基因组成型表达会产生成熟度不同的种子，进而导致无法精确研究基因在种子休眠调控中的作用。为了避免基因多重功能的干扰，构建种子特异性表达的载体是一个有效的途径。At4g28520编码12S种子储藏蛋白，特异地在种子中高量表达，利用该基因的启动子（命名为12S启动子）构建种子特异性表达载体，改造的载体分别命名为12S-pLeela和12S-pJawoh18-RNAi。通过分析12S::GUS转基因株系的GUS染色结果和GUS表达量，证明12S种子特异性表达载体是在种子发育后期、胚胎特异性表达的载体。\n 为验证所构建的12S种子特异性表达载体的有效性，将5个候选基因(H2B-2、FT即FLOWERINGLOCUST、At3g63040即FES、Atlg05510和MAF即MADSAFFECTINGFLOWERING4)分别构建到12S种子特异性表达载体上，转化拟南芥Arabidopsisthaliana，并获得T2代单拷贝纯和株系。通过分析转基因种子的休眠表型，发现12S::FT转基因种子的休眠程度较野生型更深，推测FT具有促进种子休眠的功能。休眠程度最深的12S::FT转基因株系6-3的种子在储藏7周时仍不能萌发。然而经过4℃层积处理后，其萌发率达到95％以上，表明6-3的低萌发率不是由于种子失活引起的。进一步分析结果显示，与野生型种子相比，12S::FT转基因种子的萌发对赤霉素合成抑制剂(PAC)更敏感，且敏感程度与各株系的休眠程度相吻合，表明FT对种子休眠的调控可能与GA途径有关。与野生型相比，12S::FT转基因种子的萌发对ABA的敏感性无显著差异，表明FT对种子休眠的调控可能与ABA途径无关。\n 通过分析12S::FES转基因种子和12S-RNAi-FES转基因种子的休眠表型，发现FES具有抑制休眠的功能。通过对FES蛋白生物信息学分析发现该蛋白没有任何保守结构域，仅与拟南芥的另一个亚种Arabidopsislyrata中的一个未知功能的蛋白有82％的序列相似性，而在其他物种中同源蛋白的相似性均低于30％。此外，分析发现该蛋白具有一个跨膜域，并且其N端前70个氨基酸可能为信号肽。将该可能的信号肽的编码序列构建于CFP的N端，瞬时转化小烟草，观察发现该蛋白可能定位于细胞膜上。