猪细胞色素P450（CYP）3A22的原核重组表达及结构功能鉴定

作     者：林慧娜 

作者单位：华南农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邓诣群

授予年度：2010年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：猪细胞色素P450 猪CYP3A22亚型 原核重组表达 结构功能 鉴定指标 

摘      要：细胞色素P450(cytochromeP450，简称CYP450)是一类重要的亚铁血红素—硫醇盐蛋白超家族，由多种同工酶组成，在生物体内参与多种内源性物质的生物合成与降解，以及一些外源性化合物的代谢转化。近年来，畜禽产品中有害物质和药物残留逐渐成为食品安全监控的重点。研究表明人CYP 3A4是一种普遍存在于肝脏和肠上皮细胞的药物代谢关键酶。猪的细胞色素P450 3A22和人CYP 3A4的DNA序列相似性为75%，且两者在活性与结构的关键氨基酸位点上存在高度保守，因此我们推测，CYP 3A22可能是猪体内异源物质代谢中的关键酶。\n 目的：细胞色素CYP是一类膜结合蛋白，具有性质不稳定、容易聚集的特点，本课题重点针对猪CYP 3A22亚型，构建其重组蛋白原核表达与纯化体系。通过筛选合适的原核表达载体，优化重组蛋白的表达和纯化条件，结合蛋白质工程改造，期望最终获取一定量具有天然构象和催化活性的重组目的蛋白，进而对其结构与功能进行深入研究。\n 方法：本研究选用pCold TF、pET-28a、pET-32a和pET-43a四个表达载体进行比较筛选，从中确定有利于目的蛋白可溶性表达的最佳载体；比较宿主菌BL21和Ressetta的表达效果，选择最适的表达菌；确定IPTG诱导时的最适菌液OD600、培养温度和时间等参数，优化表达条件；利用定点突变的方法进行蛋白质工程改造，从而改善重组蛋白的表达量和溶解性；最后利用His tag单克隆抗体和人CYP 3A多克隆抗体对重组蛋白进行Western Blot鉴定，用圆二色谱测定其二级结构，并通过底物孵育结合HPLC检测特异性产物，以鉴定其酶催化活性。\n 研究结果：猪CYP 3A22重组蛋白的最适原核表达载体为pET28a，BL21为最适宿主表达菌，IPTG诱导的最适菌液浓度OD600为0.6～0.7，20℃诱导24h有利于目的蛋白的可溶性表达。经过一系列蛋白质工程改造之后得到了一个最佳突变体，它在目的蛋白的表达量和溶解度方面均有显著改善，该突变体是用6个亲水性氨基酸（KKREKR）替换了N端原有的39个疏水性氨基酸。对该重组蛋白进行结构与功能鉴定，圆二色谱检测结果显示重组蛋白CYP 3A22具有典型的α-螺旋结构；底物孵育实验可检测到特异性产物的生成，表明重组蛋白CYP 3A22具有一定的酶催化活性。\n 结论：本研究成功构建了猪CYP 3A22重组蛋白的原核表达与纯化体系，获得了具有天然构象和催化活性的重组酶蛋白，为进一步深入探讨关键CYP P450酶的结构与功能打下坚实的基础。