基于狼蛛转录组筛选的一种多肽毒素结构和功能研究

作     者：苏格 

作者单位：湖南师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曾雄智

授予年度：2018年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：转录组学 酸敏感离子通道 原核表达 多肽毒素 调制剂 生理和病理 

摘      要：狼蛛在我国有广泛的分布,其毒液中含有种类丰富的多肽毒素,这些毒素可以迅速结合中枢或外周神经系统的重要受体,从而麻痹或是杀死猎物。我国狼蛛资源丰富,但是大部分狼蛛的毒素都没有得到研究。本研究选取分布在云南省的格氏狼蛛为研究对象,挖掘其毒液中具有活性的多肽毒素。利用Illumina测序技术对格氏狼蛛毒腺转录组进行测序和分析,共获得40819个Unigene,通过Blast 比对Nr数据库,获得15005个被注释的Unigene。根据KEGG数据库,对格氏狼蛛毒腺转录组的Unigene进行了 Pathway生物学通路的注释和预测,共有10853个Unigene被注释。从Unigene中查找到5282个SSR位点,占Unigene总数的比例是12.94%。酸敏感离子通道(Acid-Sensing Ion Channels,ASICs)是一种由胞外质子激活的阳离子通道,在多种神经元和非神经元组织中表达。作为质子门控通道,它与许多受pH影响的病理生理功能密切相关,与很多疾病有一定的联系。多肽毒素因为具有高活性高选择性的特点,因此成为研究ASIC结构、功能和生物学作用的重要药理工具。现在有多种ASIC调制剂来自动物多肽毒素如蛇、海葵和蜘蛛等。经过NCBI-BLAST L比对转录组蛋白测序结果后,识别了一条多肽序列(LGTX-F2)。该多肽毒素的相对分子质量为7452Da,由65个氨基酸残基构成,含8个半胱氨酸和4对二硫键,一级结构为AKACTPRLHDCSHDRHSCCRGELFKDVCYCFYPEGEDKTEVCSC QQPKSHKYIEKWDKTKTLVG。为了进一步鉴定 LGTX-F2 的功能,本研究构建LGTX-F2表达载体,并转入大肠杆菌感受态细胞BL21中扩大培养,获得的表达蛋白采用亲和层析方法分离,分离后的融合蛋白用TEV酶切获得目的多肽。采用膜片钳技术进行活性检测,发现LGTX-F2对酸敏感通道有明显的抑制活性。研究发现LGTX-F2能明显的抑制ASICla通道电流,10 μM的LGTX-F2长时间孵育(120 s)后,ASICla抑制率可达93.8±0.5%,同时LGTX-F2对ASICla的电流抑制具有浓度依赖性,其IC50为5.8μM。进一步研究发现,LGTX-F2对ASICla的抑制是可逆的,在10μMLGTX-F2作用120 s后,连续洗脱80 s可使ASICla的电流完全恢复。同时研究了酸敏感通道突变体ASICla F350A对LGTX-F2的作用效果,实验显示抑制率由93.8士0.5%降至66.72士5.6%。同时还探究了毒素对通道质子敏感性的研究发现,LGTX-F2对酸敏感通道不具有pH依赖性。除了 ASICla外,LGTX-F2可以抑制ASIC3通道,在10 μM LGTX-F2毒素的作用下,抑制率可达93.8±0.6%,其IC50为4.6μM。同时,高浓度的LGTX-F2对其他ASICs亚型无明显作用。为了进一步验证LGTX-F2的选择性,筛选了毒素对DGR细胞上钠通道、钾通道和P2X3受体通道的活性,发现LGTX-F2对上述通道基本上无抑制活性。综上所述,本研究从格氏狼蛛毒素转录组学发现了一种多肽毒素LGTX-F2,通过膜片钳活性鉴定发现该毒素是一种酸敏感离子通道抑制剂。LGTX-F2选择性作用于酸敏感离子通道ASICla和ASIC3,可以作为探究癫痫、亨延顿氏病、缺血性脑中风等疾病生理病理机制的工具分子。同时,LGTX-F2是为数不多的对ASIC3具备抑制活性的多肽毒素,而ASIC3是一个治疗细胞外酸化所致疼痛的重要靶点,因此该毒素将有助于进一步加深了 ASIC3与外周疼痛的了解。