基于CDK5 DNA甲基化研究电针对SAMP8小鼠海马区Tau蛋白磷酸化的影响及作用机制

作     者：马冉 

作者单位：湖北中医药大学 

学位级别：博士

导师姓名：孔立红

授予年度：2020年

学科分类：1005[医学-中医学] 100512[医学-针灸推拿学] 10[医学] 

主      题：阿尔茨海默病 电针 神经原纤维缠结 tau蛋白 CDK5 DNA甲基化 

摘      要：目的本项研究基于表观遗传修饰紊乱与阿尔茨海默病（Alzheimer s disease,AD）发病的高度相关性,以细胞周期蛋白依赖性激酶5（CDK5）DNA甲基化水平降低致使其过度激活进而导致tau蛋白过度磷酸化为切入点,旨在探讨电针对SAMP8小鼠学习记忆能力、神经元及突触超微结构的影响,初步阐明电针防治SAMP8小鼠学习记忆障碍的效应及表观遗传学作用机制,以期为电针干预AD提供科学的实验依据。方法选取SPF级5月龄雄性SAMR1和SAMP8小鼠共72只,体重（13±3）g,适应性喂养一周后,进行Morris水迷宫实验筛选出合格小鼠,随机分为SAMR1正常对照组12只,SAMP8小鼠60只随机分为模型组、假电针组、2Hz电针组、抑制剂组和电针+抑制剂组,每组12只。对照组和模型组不做任何处理,在治疗组治疗的同时,用相同规格的固定台进行抓取和捆绑;电针组选用“百会、“肾俞干预,于“百会向前平刺3_5 mm,“肾俞向后正中线、与皮肤呈45°角斜刺5 mm。接上HA NS-200A型电针治疗仪,一对导线分别接百会和肾俞穴,左右侧肾俞交替使用,选用连续波,频率2Hz,电流1mA,以穴位局部微颤为佳,留针20min,每日1次,7日为1疗程,疗程间休息1日,治疗4个疗程共31天;假电针组接电针但不通电;抑制剂组和电针+抑制剂组从第四疗程开始连续7天给予DNA甲基转移酶抑制5-aza-2 -deoxycytidine处理（腹腔注射给药0.2mg/kg/天）。各组小鼠干预结束后,行Morri s水迷宫实验评价各组小鼠的空间学习记忆能力。水迷宫实验结束后进行新鲜海马组织取材和灌注取材并进行指标检测:应用透射电镜观察海马CAI区神经元形态、突触数目、突触超微结构的变化;应用Western-blot检测各组小鼠海马区tau-5、tau-pS262、tau-pS404、PHF-1、CDK5、p25及DNMT1蛋白表达水平;应用免疫组化法观察CDK5的阳性神经元数目;应用荧光定量PCR检测各组小鼠海马区CDK5 mRNA表达水平;应用甲基化特异性PCR检测各组小鼠海马区CDK5 DNA启动子区甲基化水平。结果1.电针对SAMP8小鼠学习记忆能力的影响:（1）各组SAMP8小鼠体征情况观察:正常组毛色亮泽,精神状态好,进食、饮水及对外界刺激反应正常;与正常组相比,模型组小鼠毛色亮泽度稍差,有轻微脱毛和饮食减少,对外界疼痛、声音等刺激反应稍迟钝;与模型组相比,抑制剂组毛色枯黄,脱毛,饮食减少,动作缓慢,对外界刺激反应迟钝,而电针组、假电针组、电针+抑制剂组小鼠毛色、精神状态及对外界刺激反应优于模型组,且电针+抑制剂组优于抑制剂组,电针组优于假电针组。（2）各组SAMP8小鼠Morris水迷宫定位航行实验结果:与正常组相比,模型组小鼠平均逃避潜伏期明显延长（P0.01）;与模型组相比,电针组、假电针组、电针+抑制剂组小鼠平均逃避潜伏期明显缩短（P0.05）,抑制剂组小鼠平均逃避潜伏期明显延长（P0.05）;与假电针组相比,电针组小鼠平均逃避潜伏期明显缩短（P0.05）。（3）各组SAMP8小鼠Morris水迷宫空间探索实验结果:与正常组比较,模型组小鼠首次跨越平台时间明显延长、跨越平台次数明显减少,原平台象限停留时间缩短（P0.01）;与模型组相比,抑制剂组小鼠首次跨越平台时间明显延长、跨越平台次数明显减少,原平台象限停留时间缩短（P0.05）,而电针组、假电针组小鼠首次跨越平台时间明显缩短、跨越平台次数明显增加,原平台象限停留时间延长（P0.01）;与抑制剂组相比,电针+抑制剂组小鼠首次跨越平台时间明显缩短、跨越平台次数明显增加,原平台象限停留时间延长（P0.05）。（4）各组SAMP8小鼠Morris水迷宫空间辨别能力实验结果:与正常组相比,模型组正确反应次数降低（P0.01）;与模型组相比,电针组、假电针组正确反应次数增加（P0.01）;与抑制剂组相比,电针+抑制剂组小鼠正确反应次数增加（P0.05）,但低于电针组（P0.05）。2.电针对SAMP8小鼠海马CAⅠ区的神经元和突触的影响:（1）各组小鼠海马CAⅠ区神经元超微结构可见:正常组和电针组神经元形态完整,核和膜结构清晰,可见较多数量的细胞器,内质网、线粒体、溶酶体和高尔基体等形态正常;模型组神经元形态不规则,核和膜结构模糊不清,神经元体积缩小,线粒体数目减少、肿胀并伴随线粒体嵴畸形样改变;抑制剂组神经元形态不规则,核和膜结构模糊不清,神经元体积明显缩小,线粒体数目减少,肿胀并伴随线粒体嵴畸形样改变,内质网、溶酶体和高尔基体等形态均改变。假电针组神经元形态较规则,细胞器数目较电针组减少,胞质水肿严重,胞核固缩,内质网、核糖体及线粒体未见明显异常。电针+抑制剂组形态